寒區(qū)湖庫型水源供水系統(tǒng)中耐氯菌的生長

祝澤兵，吳晨光，鐘 丹，袁一星，單莉莉，袁 媛，魏星際，張 杰

(1.城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室(哈爾濱工業(yè)大學)，150090哈爾濱;2.哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，150090哈爾濱;3.華東交通大學土木建筑學院，330013南昌;4.哈爾濱供水工程有限責任公司，150060哈爾濱)

由于氯的消毒效率高、穩(wěn)定性好、易于使用、成本低廉等優(yōu)勢，仍然是使用最廣泛的消毒劑［1］.研究發(fā)現(xiàn)在保持一定余氯濃度的條件下，仍然有細菌能夠存活，甚至有一部分細菌能夠在含有較高余氯濃度的自來水廠、管網(wǎng)等供水系統(tǒng)中生存.這些對氯具有較高耐受性的細菌被稱作“耐氯菌”(chlorineresistant bacteria，也譯為“抗氯菌”)［2-4］.然而，由于消毒效率跟測試的條件、方法密切相關(guān)，在科學的范疇上，耐氯菌的耐受性只是一個相對的概念，并不是一個準確的術(shù)語［5-6］.

加氯消毒的過程本身就是對耐氯菌選擇的過程［5］，也會使耐氯菌成為優(yōu)勢菌［7］.這些存在于供水系統(tǒng)中的耐氯菌會對飲用水的安全性造成巨大危害.一方面有些耐氯菌本身就是病原菌或者條件致病菌，如分枝桿菌(Mycobacteriumspp.)、軍團菌(Legionellaspp.)、銅綠色假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等［8-10］;另一方面，由耐氯菌導致氯消毒的失效，并由此引發(fā)供水管網(wǎng)中的細菌再生長，進一步增加了細菌的耐氯性，使得供水管網(wǎng)中的細菌狀況進一步加劇，進而引起用戶龍頭水細菌總數(shù)、色度、濁度等水質(zhì)指標超標［11-13］.由于耐氯菌處于一個貧營養(yǎng)條件下并維持較高濃度余氯的極端環(huán)境體系下，大大限制了對供水管網(wǎng)中耐氯菌的研究.為此，對東北某市寒區(qū)湖庫型水源凈水廠加氯前后和供水管網(wǎng)中不同水齡、管道材質(zhì)、管齡的主體水和生物膜中耐氯菌的變化規(guī)律進行研究，以期為供水微生物安全的評估、預防和控制提供理論基礎(chǔ).

1 實 驗

1.1 寒區(qū)湖庫型水源供水系統(tǒng)描述

該供水系統(tǒng)由典型的寒區(qū)湖庫型水源凈水廠供水［14］，原水濁度為 0.34～14 NTU，pH 6.10～7.49，堿度(CaCO3)8～48 mg/L，氨氮為 0.04～0.20 mg/L.檢測數(shù)據(jù)均值中除大腸菌群為Ⅱ～Ⅲ類外，其他項目均滿足Ⅱ類水質(zhì).凈水廠建于2006—2009年，常規(guī)處理工藝為機械混合+水平軸機械絮凝+斜管沉淀+雙層濾料翻板濾池過濾+液氯消毒，設(shè)計總供水能力90×104m3/d，目前實際最高日供水量約為 79×104m3/d，平均日供水量 67×104m3/d.

根據(jù)該市的區(qū)域供水管網(wǎng)特征和水質(zhì)特點，選取具有代表性的供水管網(wǎng)開展對比分析，該供水系統(tǒng)取樣點基礎(chǔ)信息見表1.

表1 供水系統(tǒng)取樣點基礎(chǔ)信息

1.2 分析測定方法

在該市某凈水廠清水池和供水系統(tǒng)(二次供水水箱)清洗期間(一般1年清洗1次，清洗時間為4月末—6月初或9—10月)，于凈水廠濾池生物膜直接采集濾池反沖洗前期廢水顆粒(干樣約為10 g)，采集清水池出水端下部高0.5 m處面積約50 cm×50 cm的池壁生物膜，水廠食堂連接水龍頭PPR管面積約100 cm2的管內(nèi)壁生物膜，二次供水水箱進水端下部高0.15 m處面積約30 cm×30 cm池壁生物膜.在清洗前，開展供水系統(tǒng)的主體水水質(zhì)測定，為期1 a，每月采集水樣一次，包括水廠濾后水、清水池出水、食堂龍頭水和各二次供水水箱市政進水5 L.所采得的生物膜和主體水水樣及時運回實驗室，并保存于4℃冰箱，在8 h內(nèi)進行相關(guān)項目的分析.其中耐氯性細菌檢測的水樣與生物膜在同一時期內(nèi)采集.

1.2.1 生物膜和進出水異養(yǎng)菌平板計數(shù)(HPC)測定

將待計數(shù)的生物膜懸浮液置于超聲波振蕩器中冰浴超聲振蕩1 min，間歇1 min，如此重復3次，然后再漩渦振蕩30 s，使生物膜中的細菌能夠均勻分布在懸浮液中，之后將懸浮液稀釋適宜質(zhì)量濃度在R2A固體培養(yǎng)基上進行異養(yǎng)菌總數(shù)平板計數(shù)(HPC-R2A)［15］.R2A固體培養(yǎng)基主要成分:酵母0.5 g，酪蛋白酸水解物 0.5 g，可溶性淀粉 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，胰蛋白胨 0.25 g，蛋白胨 0.25 g，葡萄糖 0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，K2HPO40.3 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 L;并用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉調(diào)節(jié) pH 為7.2～7.4.主體水、濾后水和供水末端水樣直接倍比稀釋，涂布于R2A固體培養(yǎng)基上;清水池和供水前端水樣用0.22μm濾膜過濾10～100 mL的水樣，然后將濾膜截濾微生物的一面向上貼于R2A固體培養(yǎng)基上進行HPC計數(shù).將處理好的R2A培養(yǎng)基平板放于20℃倒置恒溫培養(yǎng)10 d，即可獲得異養(yǎng)菌平板計數(shù).

1.2.2 耐氯性細菌檢測

耐氯性細菌檢測參考陸品品［16］和 Mathieu等［17］的方法，并做適當修改.對于生物膜樣品，在加氯前，引入超聲波和漩渦振蕩法分散細胞群體生物膜，使生物膜中的個體細胞釋放出來，盡量減少消毒劑在生物膜基質(zhì)中擴散限制和反應抑制作用［4，18］，使得氯能滲透到更多細菌個體細胞表面，耐氯的細菌得以檢出.檢測方法如圖1所示，將混勻的生物膜懸浮液(經(jīng)1.2.1方法處理)和主體水樣品，置于經(jīng)過滅菌處理的取樣瓶(1 L棕色細口瓶，密封).其中1份樣品保持一定質(zhì)量濃度的Cl2消毒劑(根據(jù)出廠水的平均余氯質(zhì)量濃度，加入NaClO溶液使pH調(diào)至近中性.由于生物膜懸浮液會消耗更多的余氯，在生物膜懸浮液中比主體水中多加20%～50%的余氯溶液［19］，混勻，待余氯穩(wěn)定后再測余氯質(zhì)量濃度，使主體水和生物膜懸浮液的余氯終質(zhì)量濃度均保持在0.60 mg/L)，常溫過夜靜置12 h(根據(jù)該市的區(qū)域供水管網(wǎng)特征和水質(zhì)特點，選取處于該市供水管網(wǎng)中間位置的H5采樣點的水力停留時間，具有代表性);另1份樣品加入Na2S2O3，中止消毒，冷藏保存.12 h后，依據(jù)1.2.1的檢測方法取樣測定這2瓶水樣中的HPC-R2A值，重復3次以中止消毒樣品中HPC-R2A值作為管網(wǎng)出水細菌本底值，另一份樣品為維持消毒劑作用12 h后HPC-R2A值，作為管網(wǎng)出水可能的耐氯菌檢測值.

圖1 耐氯性細菌檢測方法示意

1.2.3 主體水其他水質(zhì)測定方法

1.2.4 掃描電鏡觀察

采用掃描電鏡觀察上述生物膜的形態(tài)，掃描電鏡樣品前處理方法:樣品在2.5%的戊二酸溶液中4 ℃固定過夜;倒掉固定液，用 0.1 mol/L、pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min;冷凍干燥;樣品黏附在樣品臺上，噴金，在Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)上觀察.

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

耐氯性細菌檢測時加入 0.60 mg/L的 Cl2，經(jīng)12 h的滅活率為D=log10(N0/Nc)，其中N0為不加氯12 h后的 HPC-R2A值，Nc為加氯 12 h后的HPC-R2A值.運用 SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件對常規(guī)指標和細菌總數(shù)等進行方差分析和相關(guān)性分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 供水系統(tǒng)主體水細菌再生長

表2為供水系統(tǒng)不同取樣點主體水水質(zhì)，可以看出，該供水系統(tǒng)的出廠水(清水池水樣)均優(yōu)于《生活飲用水衛(wèi)生標準 GB 5749—2006》規(guī)定的相應水質(zhì)指標，出水水質(zhì)較好.如表1，2所示，本研究所選擇的供水系統(tǒng)在一個完整的監(jiān)測周期內(nèi)，細菌再生長現(xiàn)象隨著供水管線的延長有增大的趨勢，但相關(guān)不顯著.供水管網(wǎng)中細菌數(shù)目與管材、管齡相關(guān)度不明顯，在新管網(wǎng)(管齡1～4 a)中細菌再生長現(xiàn)象仍然很普遍，很嚴重.供水管網(wǎng)中細菌數(shù)目與消毒劑質(zhì)量濃度呈一定的負相關(guān)(r=-0.51，p=0.04)，由于消毒劑的存在細菌再生長現(xiàn)象在管網(wǎng)中受到一定程度的抑制，但這種抑制很有限，在余氯質(zhì)量濃度大于0.2 mg/L時仍然存在大量的細菌.Zhang等［21］在美國北卡羅萊納州Durham縣的兩座加氯供水系統(tǒng)也發(fā)現(xiàn)了細菌再生長現(xiàn)象，并且認為消毒劑質(zhì)量濃度是決定HPC水平的最重要因子，管網(wǎng)中的細菌再生長是管網(wǎng)中水質(zhì)化學、物理及運行參數(shù)等復雜交互作用的結(jié)果，而不是簡單的統(tǒng)計學關(guān)系.因此，需要重點開展供水管網(wǎng)主體水和生物膜細菌再生長及耐氯性細菌的研究.

表2 供水系統(tǒng)不同取樣點主體水水質(zhì)

2.2 供水系統(tǒng)主體水和生物膜中耐氯性細菌

2.2.1 主體水中耐氯性細菌的存在性分析

如圖2所示，所選取的6個取樣點中，主體水中總細菌和耐氯細菌的存在差別很大.該供水系統(tǒng)中異養(yǎng)菌總數(shù)在50～22 000 CFU/mL，濾后水在清水池消毒后達近3-log滅活率，加氯消毒去除了大部分微生物.在不同水樣中繼續(xù)加入0.6 mg/L的Cl2，發(fā)現(xiàn)各采樣點仍存在一定數(shù)目的細菌(130～830 CFU/mL)，可以認為這部分細菌具有較高的抗氯性，為耐氯菌［3，6］.濾后水中的耐氯菌數(shù)目最多(830 CFU/mL)，顯著大于其他加氯后主體水的耐氯菌數(shù)目(P＞0.01).在出廠水 0.6 mg/L 余氯水平下，自來水經(jīng)管網(wǎng)輸送，耐氯菌的數(shù)量隨著管線的延長逐漸增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其中存在的耐氯菌在管網(wǎng)中一般小于350 CFU/mL，各管網(wǎng)采樣點的耐氯性檢測的氯滅活率均不到35%.研究表明，在出廠水水質(zhì)較好的管網(wǎng)中，管網(wǎng)生物膜是主體水微生物的的主要來源［22］，因此，可以推測該部分細菌可能主要來源于管壁生物膜的脫落，而脫落的管壁生物膜的微生物在氯的存在下仍然可以再生長［21，23?，這些脫落的管壁生物膜中的微生物勢必會對飲用水安全性造成危害.生物膜的存在對部分細菌起到了保護作用，使其免于消毒劑的滅活，從而在高質(zhì)量濃度余氯的供水管網(wǎng)中存活［1，4］，而且懸浮顆粒上的細菌與懸浮菌相比抗氯性至少增加44%［24］.因此，管壁生物膜的沖刷脫落是該供水管網(wǎng)出水細菌耐氯的重要來源之一.

圖2 供水系統(tǒng)主體水中總細菌和耐氯細菌數(shù)目

2.2.2 生物膜中耐氯性細菌的存在性分析

圖3是該供水系統(tǒng)生物膜中總細菌和耐氯細菌的分布.在水廠反沖洗廢水顆粒中存在109CFU/g的細菌，經(jīng)耐氯菌檢測后還存在104CFU/g，顯著大于其他加氯后的生物膜耐氯菌數(shù)目(P＜0.05).在清水池壁上的總細菌和耐氯菌數(shù)目只有103CFU/cm2，這說明經(jīng)水廠過濾后截留了大量的細菌，而耐氯菌相對不容易被截留.研究表明，在經(jīng)過濾處理的加氯(約為0.5 mg/L Cl2)自來水中發(fā)現(xiàn)了大量的極微細菌(＜0.20μm)［25］.經(jīng)消毒輸送至管網(wǎng)后，管網(wǎng)生物膜的總細菌數(shù)超過106CFU/cm2，耐氯菌數(shù)目也維持在103CFU/cm2水平.結(jié)果表明，隨著管網(wǎng)延伸，管網(wǎng)生物膜的耐氯細菌數(shù)目也呈增長趨勢.隨著消毒劑質(zhì)量濃度的下降，管網(wǎng)生物膜中的細菌數(shù)目也在逐步上升，其中耐氯細菌也會進一步增加.

圖3 供水系統(tǒng)生物膜總細菌和耐氯細菌數(shù)目

2.2.3 主體水和生物膜中耐氯性細菌的對比

圖4為該供水系統(tǒng)主體水和生物膜懸浮液中細菌滅活率的對比.與主體水相比，生物膜懸浮液中的細菌滅活率均較大.一般認為細菌的抗氯機制可以分為細菌的個體原因和群體原因［18］，即可以分為浮游生物的抗氯性和細菌群體生物膜的抗氯性，實際供水系統(tǒng)中細菌群體生物膜抗氯性占大多數(shù)［4，18］.由于消毒劑在細菌群體生物膜基質(zhì)中的擴散限制和反應抑制，消毒劑不能深入生物膜底層;同時，細菌長期在亞致死質(zhì)量濃度的消毒劑中生長也會導致部分個體細菌的抗氯性增加［4，18］.在生物膜中細菌對消毒劑的抗性，很多時候并不是該細菌的真正抗性，當生物膜基質(zhì)的保護作用得以消除，這部分細菌將會被消毒劑殺死［1，4］.而本研究主要檢測的是個體細菌的耐氯性，因此，生物膜懸浮液中的大部分細菌會被氯殺滅.清水池水樣中，在0.6 mg/L的余氯條件下，細菌數(shù)目還會繼續(xù)增加，這說明在高質(zhì)量濃度余氯生長的細菌大多比較耐氯.雖然主體水中的細菌滅活率要小于生物膜中的細菌滅活率，但生物膜中細菌數(shù)目高于主體水中細菌數(shù)目3～5個數(shù)量級，生物膜中耐氯菌數(shù)目也一般高于主體水的耐氯菌數(shù)目2個數(shù)量級，因此，在生物膜中更容易發(fā)現(xiàn)耐氯菌.由于生物膜中存在諸如胞外聚合物(EPS)等復雜的組分和更多的群體細菌數(shù)目，減少了消毒劑在生物膜基質(zhì)中的擴散限制和反應抑制作用，使得生物膜中細菌具有更強的抗氯性［18］.本研究在檢測生物膜中的耐氯菌時，首先通過超聲波和漩渦振蕩法分散細胞群體生物膜，使生物膜中的個體細胞釋放出來，盡量減少消毒劑在生物膜基質(zhì)中的擴散限制和反應抑制作用，也盡量使“真正”的耐氯細菌能得以檢出.

圖4 供水系統(tǒng)主體水和生物膜懸浮液中細菌滅活率的對比

管網(wǎng)生物膜是主體水微生物的的主要來源，是導致水質(zhì)惡化的主要原因［9，22］.然而從供水系統(tǒng)中完全去除生物膜幾乎是不可能的［9］，可以從以下幾個方面來控制和減少生物膜的生長:采用深度處理工藝降低出廠水的營養(yǎng)物質(zhì)，采用UV+液氯聯(lián)合消毒降低出廠水的微生物數(shù)量，提高余氯質(zhì)量濃度，管網(wǎng)中二次加氯，增大管網(wǎng)內(nèi)的水流速，在用戶入管盡量采用不銹鋼和PE材質(zhì)的管道材料;對于已經(jīng)產(chǎn)生較多管網(wǎng)生物膜的區(qū)域，可以定期進行消毒劑+沖洗聯(lián)合清洗方式去除大部分生物膜，在用戶終端采用一些水凈化和消毒(UV 或 O3)裝置［4，9，15，26］.

2.3 供水系統(tǒng)生物膜掃描電鏡觀察

供水系統(tǒng)6個樣品生物膜的掃描電鏡觀察結(jié)果見圖5.可以看出，在水廠濾池反沖洗前期廢水的顆粒中能明顯看到微生物，能見桿菌和球菌，以桿菌居多，經(jīng)加氯消毒后在清水池池壁上未觀察到微生物.出廠水在管網(wǎng)輸送過程中，生物膜中的微生物細胞數(shù)目隨著輸送距離的增加有增多的趨勢.在管網(wǎng)的中末端，鍍鋅鐵和水泥瓷磚材料上的生物膜中微生物數(shù)量較多，且能見細菌團聚的形式存在，并形成了明顯的腐蝕瘤.電鏡照片顯示腐蝕瘤內(nèi)部是豐富的微生物，亦能見桿菌和球菌，以桿菌居多.玻璃鋼材料上的生物膜中微生物數(shù)量也較多，而PPR管材上的生物膜中微生物數(shù)量相對較少，這可能是因為只經(jīng)過了很短的管網(wǎng)輸送(300 m).上述觀察結(jié)果與細菌總數(shù)趨勢完全一致.而在微生物種類上，這幾種材料上生物膜中的微生物均能見桿菌和球菌，以桿菌居多.王薇等［27］和張向誼［28］等研究給水管網(wǎng)管壁微生物生長特性時發(fā)現(xiàn)，給水管網(wǎng)管壁中的微生物以球菌和桿菌為主，與本文研究結(jié)果基本一致.從電鏡照片上看，不同材料上附著的生物膜的微生物形態(tài)相對比較接近，能見桿菌和球菌，以桿菌居多，差異不明顯.

圖5 供水系統(tǒng)生物膜掃描電鏡觀察結(jié)果

3 結(jié)論

1)細菌再生長現(xiàn)象隨著供水管線的延長有增大的趨勢，但相關(guān)不顯著.供水管網(wǎng)中細菌數(shù)目與管材、管齡相關(guān)度不明顯，在新管網(wǎng)(管齡1～4 a)中細菌再生長現(xiàn)象仍然很普遍，很嚴重.供水管網(wǎng)中細菌數(shù)目與消毒劑質(zhì)量濃度呈一定的負相關(guān).

2)耐氯菌在該供水系統(tǒng)中普遍存在，生物膜中耐氯菌數(shù)目一般高于主體水中2個數(shù)量級.在清水池高質(zhì)量濃度余氯環(huán)境下生長的細菌大多比較耐氯.

3)不同供水材料上生物膜的微生物形態(tài)能見桿菌和球菌，以桿菌居多.

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