UPLC—MS/MS法在藥物成分分析領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展

王沛　李建定

【摘 要】超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra - high performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）結(jié)合了超高效液相色譜強大的分離能力和質(zhì)譜在定性、定量分析方面的高靈敏度及專屬性強優(yōu)勢，較好地適應(yīng)了現(xiàn)代藥物研究對自動化、高通量分析方法的需求，已成為藥物分析的重要方法之一。綜述了UPLC-MS/MS 法在藥物成分分析領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展。

【關(guān)鍵詞】UPLC-MS/MS；藥物成分分析

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)由液相色譜、質(zhì)譜及接口技術(shù)三部分組成，相對于通常的檢測方式，能提供更優(yōu)越的選擇性和更低的檢測限，已成為現(xiàn)代實驗室一種快速、準確的分析工具。超高效液相色譜（UPLC）是美國Waters公司于2004年3月正式推出的分離科學(xué)新技術(shù)。它是基于小顆粒填料和LC原理的一種創(chuàng)新方法，實現(xiàn)了超高分離度、靈敏度和分析速度。質(zhì)譜（MS）是離子，如分子離子，碎片離子等按質(zhì)荷比（m/z）大小而依次排列的譜圖，通過對樣品氣相離子質(zhì)荷比大小和豐度的測定進行化合物的組分分析和結(jié)構(gòu)分析，是化合物的“化學(xué)指紋圖譜”之一。

UPLC是質(zhì)譜檢測器的最佳液相色譜入口，除UPLC本身帶來的速度、靈敏度和分離度的改善外，UPLC的超強分離能力有助于目標化合物與之競爭電離的雜質(zhì)的分離，從而可以使質(zhì)譜檢測器的靈敏度因離子抑制現(xiàn)象的減弱或克服而得到進一步的提高。UPLC與MS聯(lián)用，可以充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢，與傳統(tǒng)的高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）相比，顯著提高了定量分析的重復(fù)性和可靠性以及定性分析的準確性，較好地適應(yīng)了現(xiàn)代藥物研究對自動化、高通量分析方法的需求，已成為藥物分析的重要方法之一[1-4]。本文綜述了UPLC-MS/MS法在藥物成分分析領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展。

1 藥物成分的快速化學(xué)表征

王邱等以超高效液相為分離手段，飛行時間質(zhì)譜儀為鑒定方法，水飽和正丁醇為提取溶劑，以0.05%甲酸水（A）-0.05%甲酸乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫，采用ESI負離子模式進行數(shù)據(jù)采集。根據(jù)實驗結(jié)果，并結(jié)合相關(guān)參考文獻，二級質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)以及元素組成，分離、鑒定出17種皂苷類成分，并發(fā)現(xiàn)三七中含有姜糖酯B成分。實驗結(jié)果表明經(jīng)過超高效液相的分離，及質(zhì)譜二級負離子信息的鑒定，為分析三七中皂苷類成分提供了一種快速、簡便、可靠的方法，能夠為三七藥材在真?zhèn)舞b別、質(zhì)量評價、藥代動力學(xué)等方面的研究提供方法基礎(chǔ)[5]。

王金鳳等建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法，分離表征葛花中異黃酮成分。利用LTQ超高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)（美國，Therm公司），研究經(jīng)乙酸乙酯純化的葛花乙醇提取物，分離出7種異黃酮成分，經(jīng)鑒定為大豆苷、大豆苷元、鳶尾苷、鳶尾苷元、染料木黃酮、印度黃檀苷和雞豆黃素。樣品中異黃酮成分分離度較好，基線平穩(wěn)，分離效果理想，快速、準確、靈敏度高，可以作為葛花異黃酮鑒定的有效方法[6]。

池玉梅等以黃酮對照品為研究前體，藥用植物小毛茛為研究對象，采用超高效液相色譜/二極管陣列檢測器-電噴霧四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（UPLC/DAD-ESI/Q-TOF MS）分析了黃酮類化合物同系物及同分異構(gòu)體的色譜、質(zhì)譜特性。結(jié)果顯示：黃酮氧苷和黃酮碳苷的紫外吸收光譜及二級質(zhì)譜具有顯著性差異，糖苷化位置同保留時間、二級質(zhì)譜碎片及相對豐度具有相關(guān)性。將該方法應(yīng)用于小毛茛莖葉醇提液的分析，結(jié)合其酸水解液的分析，解析了22個黃酮醇糖苷和3個苷元[7]。

2 藥物成分含量測定

羅玲等建立了檢測注射用雙黃連粉針劑中7種活性成分（綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷）含量的UPLC-MS/MS方法。采用Agilent Zorbax C18色譜柱（2.1mm×50mm，1.7μm），流動相乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫，體積流量0.40mL·min-1，柱溫30℃；質(zhì)譜條件為電噴霧離子（ESI）源，負離子模式檢測，多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描。7個活性成分在考察的線性范圍內(nèi)，進樣濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好（r>0.9983），精密度RSD<4.2%；重復(fù)性RSD<6.3%，平均加樣回收率在92.2%～102.7%。該方法準確、快速、重復(fù)性好，可作為雙黃連粉針劑的質(zhì)量控制參考方法[8]。

顧瑤華等以Agilent Z0RBAx Eclipse XDB-C18為色譜柱，以乙腈-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫）為流動相，使用超高速液相色譜儀（Agilent 1200 UPLC，德國）和三重四級桿質(zhì)譜儀（Agilent QQQ-MS/MS 6410A，美國，），建立同時測定五味消炎靈含片中丹參酚酸、黃芩苷、葛根素、綠原酸、咖啡酸含量的UPLC-MS/MS方法。結(jié)果所檢測的各色譜峰分離度良好，方法學(xué)實驗結(jié)果符合要求；該方法可以為五味消炎靈含片的質(zhì)量控制提供依據(jù)[9]。

范曉蘇等建立了同時測定復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊中原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、野黃芩苷、異綠原酸C、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯III和白術(shù)內(nèi)酯I等10種有效成分含量的UPLC-MS/MS雙內(nèi)標分析方法。以咖啡酸和淫羊藿苷為內(nèi)標（IS），在ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 色譜柱上，以甲醇和含0.3%甲酸的水為流動相進行梯度洗脫分離，流速為0.3moL/min。在電噴霧電離（ESI）正、負離子切換模式下，采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式進行檢測。結(jié)果表明，原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、野黃芩苷、異綠原酸C、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯III和白術(shù)內(nèi)酯I的線性范圍分別為0.00300～24.0mg/L、0.0170～2.00mg/L、0.0150～30.0mg/L、0.00400～30.0mg/L、0.0105～24.0mg/L、0.00300～30.0mg/L、0.00300～5.00mg/L、0.00600～5.00mg/L、0.00150～4.00mg/L、0.00600～0.900mg/L；檢出限分別為1.0、11、5.0、1.5、3.5、1.0、1.0、2.0、0.5、0.2μg/L。10種成分的加樣回收率為92.5%～106%，相對標準偏差均不大于3.2%。該方法快速簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，已成功用于實際樣品的分析[10]。

3 中藥制劑中非法加入化學(xué)藥物成分檢測

黃衛(wèi)平等使用Acuity UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)（Waters公司）和Synapt G2四極桿/飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Water公司），通過比較樣品峰與對照品峰的保留時間、一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜碎片離子，建立了測定抗風(fēng)濕類中藥制劑中非法添加醋酸潑尼松、萘普生、醋酸地塞米松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和布洛芬的UPLC-MS/MS分析方法。實驗結(jié)果表明，采用UPLC-MS/MS技術(shù)，將高效液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜分析的高選擇性相結(jié)合，抗風(fēng)濕類中藥制劑樣品經(jīng)一次提取即可快速、準確地對非法摻入醋酸潑尼松、萘普生、醋酸地塞米松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和布洛芬進行多級質(zhì)譜分析，并進行了結(jié)構(gòu)確證，靈敏度高，選擇性強，增強了檢測結(jié)果的可信度，對該類中藥制劑的質(zhì)量控制具有現(xiàn)實意義[11]。

【參考文獻】

[1]黃昆，王文輝，等.超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用在藥物研究領(lǐng)域的應(yīng)[J].光譜實驗室，2009，26（4）：922-930.

[2]王勇躍，梁健謀，等.UPLC梯度洗脫法測定注射用阿洛西林鈉中有關(guān)物質(zhì)[J].中國抗生素雜志，2015，40（3）：192-196.

[3]Ying Ding， Kai Huang， et al. Simultaneous quantitative analysis of dextromethorphan， dextrorphan and chlorphenamine in human plasma by liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry [J]. Journal of Chromatography A， 2011，1218（41）：7371-7376.

[4]LU Chun-mei1， WANG Ming-tai et al. Determination of Sex Hormones in Antler Velvet by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry [J]. CHEM. RES. CHINESE UNIVERSITIES， 2012，28（2）：191-194.

[5]王邱，馮毅凡，等.UPLC /Q-TOF MS 對三七中皂苷類成分的快速化學(xué)表征[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26：1233-1239.

[6]王金鳳，魏穎，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測葛花中異黃酮[J].中成藥，2014，36（10）：2125-2127.

[7]池玉梅，李瑤，等.超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜分析黃酮類化合物及小毛茛莖葉的成分[J].色譜，2013，31（9）：838-844.

[8]羅玲，黃玉嬋，等.UPLC-MS-MS同時測定雙黃連粉針中7種活性成分[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（13）：80-84.

[9]顧瑤華，巢為農(nóng).UPLC-MS/MS測定五昧消炎靈含片中5種成分的含量[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)，2014，30（6）：578-580.

[10]范曉蘇，龐倩，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜雙內(nèi)標法同時測定復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊中的10種有效成分[J].色譜，2014，32（3）：216-223.

[11]黃衛(wèi)平，李琴，等.超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜測定抗風(fēng)濕類中藥非法添加的化學(xué)藥物成分[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（11）：2707-2714.

[責任編輯：湯靜]