知母藥材的HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜研究*

魏靜娜，劉征輝，趙琳琳，郭永澤，程　奕，溫春秀

（1.天津海世達檢測技術(shù)有限公司，天津300381；2.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，天津300381；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，石家莊050051）

·中藥研究·

知母藥材的HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜研究*

魏靜娜1，劉征輝1，趙琳琳1，郭永澤2，程奕2，溫春秀3

（1.天津海世達檢測技術(shù)有限公司，天津300381；2.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，天津300381；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，石家莊050051）

［目的］建立知母藥材的高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器-蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用（HPLC/PDA/ELSD）指紋圖譜。［方法］采用Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱，流動相為乙腈-0.1%冰醋酸，梯度洗脫流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長258 nm，ELSD檢測器載氣氣壓30 Psi，漂移管溫度80℃。［結(jié)果］建立了知母的HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜，在HPLC-PDA色譜圖中標定了17個共有峰，HPLC-ELSD色譜圖中標定了14個共有峰。［結(jié)論］該方法重復(fù)性好，可用于知母藥材的全面質(zhì)量控制。

知母；指紋圖譜；HPLC/PDA/ELSD

知母為百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的干燥根莖，主產(chǎn)于河北、山西及山東等地。春、秋兩季采挖，除去須根及泥沙，曬干，或除去外皮，曬干。切片入藥，生用，或鹽水炙用。現(xiàn)代藥理研究表明，知母具有抗炎［1-4］、降血糖［5-8］、抗阿爾茨海默病［9-12］等作用，臨床應(yīng)用安全可靠，毒副作用小［13］。在知母藥材的全面質(zhì)量控制方面，目前文獻報道的，多為采用紫外檢測器或者蒸發(fā)光散射檢測器得到的一維圖譜［14-15］，文章采用二級管陣列/蒸發(fā)光散射（PDA/ELSD）兩種檢測器串聯(lián)的方式，對河北省不同栽培區(qū)域的知母藥材指紋圖譜進行研究，得到了更加全面的知母藥材質(zhì)量控制方案。

1　儀器與材料

Waters 2695高效液相色譜儀（配有Waters2996 PDA檢測器，Waters2424 ELSD檢測器，Empower2色譜工作站），分析天平（METTLERXS205，METTLER AB54），Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

芒果苷（111607-200402，購自中國藥品生物制品檢定所），新芒果苷（X-032-140602，純度≥98%，購自成都瑞芬思科技有限公司），知母皂苷BII（111839-201102，純度90.8%，購自中國藥品生物制品檢定所），乙腈（色譜純，Merck公司），冰乙酸（色譜純，天津康科德科技有限公司），乙醇（分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

知母藥材來源見表1，經(jīng)河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所溫春秀研究員鑒定為百合科植物知母。

表1　知母藥材來源Tab.1Origins of Rhizoma Anemarrhenae

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。流動相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），梯度洗脫：0～10 min，5%～18%A；10～15 min，18%～25%A；15～25 min，25%A；25～50 min，25%～100%A；50～55 min，100%A；55～60 min，100%～5%A；60～75 min，5%A；流速：1.0 mL/min。PDA檢測器檢測波長：258 nm，ELSD檢測器：氮氣壓力30Psi，漂移管溫度80℃，進樣體積：20μL。

2.2對照品溶液的制備精密稱取新芒果苷，芒果苷，知母皂苷BII，加70%乙醇，制成每mL含0.10 mg的混合標準溶液。

2.3供試品溶液的制備取干燥的知母藥材粉末（過60目篩）0.5 g，精密稱定，置于50 mL的具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻，用70%的乙醇補足減失的重量，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，濾液作為供試品溶液。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1穩(wěn)定性實驗取1號知母藥材粉末，精密稱定，按照“2.3”項下的方法，制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24、36、48 h檢測指紋圖譜。主要共有峰保留時間及峰面積比值的RSD值分別為0.05%～0.031%，0.06%～0.013%（PDA色譜圖中的主要共有峰），1.1%～1.8%（ELSD色譜圖中的主要共有峰），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。同時發(fā)現(xiàn)50 min后，色譜圖中再沒有特征峰出現(xiàn)，色譜記錄時間50 min即可。

2.4.2精密度實驗取“2.2”項下的混合標準溶液，按照“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，各色譜峰的峰面積比值RSD均小于3%，表明精密度良好，儀器很穩(wěn)定。

2.4.3重復(fù)性實驗取1號樣品，按照“2.3”項下的供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進樣，PDA色譜圖中主要共有峰的峰面積比RSD為0.15%～0.39%，ELSD色譜圖中主要共有峰的峰面積比RSD為1.1%～2.8%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5指紋圖譜的建立根據(jù)11批供試品溶液HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜所給出的峰數(shù)、峰值和峰位等相關(guān)參數(shù)，進行比較分析，得到圖1-2所示的指紋圖譜共有模式圖。

圖1　11批知母藥材的HPLC-PDA指紋圖譜共有模式圖Fig.1Mutual mode of HPLC-PDA fingerprint of 11 batches Rhizoma Anemarrhenae

圖2　11批知母藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜共有模式圖Fig.2Mutual mode of HPLC-ELSD fingerprint of 11 batches Rhizoma Anemarrhenae

2.6指紋圖譜分析與評價

2.6.1共有峰的確定根據(jù)11批供試品溶液所得測試結(jié)果，確定HPLC-PDA指紋圖譜有17個峰為各批樣品所共有，同法確定了HPLC-ELSD指紋圖譜中的14個共有峰。見圖3-4。

圖3　知母藥材的HPLC-PDA指紋圖譜Fig.3HPLC-PDA fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

圖4　知母藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜Fig.4HPLC-ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

2.6.2參比峰的選擇在各批次樣品的HPLCPDA圖譜中，芒果苷的峰面積較大，較穩(wěn)定，所以選取芒果苷的峰（9號峰）為HPLC-PDA圖譜的參照峰；同理選取知母皂苷BII的峰（5號峰）作為HPLC-ELSD圖譜的參照峰。

2.6.3指紋圖譜的相似度評價采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”對各批知母藥材的指紋圖譜進行數(shù)據(jù)處理，生成對照圖譜，計算各樣品圖譜與對照圖譜的相似度，只有10號樣品的PDA圖譜與對照圖譜的相似度在0.9以下，其他都在0.9以上。見表2。

表2　知母指紋圖譜相似度評價結(jié)果Tab.2Similarity analysis of Rhizoma Anemarrhenae fingerprint

3　討論

3.1檢測器的選擇知母中的主要化學(xué)成分有甾體皂苷類、雙苯吡酮類、多糖類、木脂素類等［16-17］，如果單純使用PDA檢測器，由于甾體皂苷類成分沒有紫外吸收，所以，此類成分的含量將無法控制，而ELSD檢測器作為通用型檢測器，雖然理論上，只要待測物質(zhì)的沸點高于流動相，就可以使用ELSD檢測器檢出，但由于靈敏度低，所以，單純使用ELSD檢測器建立的指紋圖譜中，會缺少一些含量較低的物質(zhì)的信息。本實驗采用HPLC/PDA/ELSD聯(lián)用的方式，建立了知母藥材的多維指紋圖譜，彌補了采用單一檢測器的局限性，可以更立體的控制知母藥材的質(zhì)量［18-19］。

3.2檢測波長的選擇實驗采用3D數(shù)據(jù)采集，記錄了供試品溶液在190～400 nm的全波長色譜圖，在不同的波長下提取色譜圖，當波長低于260 nm時，基線不平，而波長大于260 nm時，各主要色譜峰的吸收又會降低，所以，選取了芒果苷的最大吸收波長258 nm為檢測波長。

3.3流動相系統(tǒng)的選擇實驗考察了乙腈-冰醋酸水溶液和乙腈-甲酸水溶液兩個流動相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)使用乙腈-冰醋酸水溶液，各峰的分離度更好，出峰時間分布更均勻，因此，最終選用了乙腈-冰醋酸水溶液作為流動相。

3.4色譜柱的選擇實驗考察了Waters SunFireTMC18、Waters Symmetry C18、Waters Symmetry ShieldTMRP C18和Dikma Diamonsil C18，結(jié)果表明，使用Waters Symmetry ShieldTMRP C18時，各峰分布更均勻，分離度更好，所以采用此色譜柱。

郭曉曄等［20］的研究揭示了栽培“西陵知母”中不同化學(xué)成分在一年中的各月份，呈現(xiàn)不同的規(guī)律性變化。實驗使用的藥材均采收于初秋8、9月份，采收于其他季節(jié)的知母藥材，可能會由于其中某些化學(xué)成分的含量處于不同時期，而與本實驗建立的對照指紋圖譜相似度較低。

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Study on HPLC/PDA/ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

WEI Jing-na1，LIU Zheng-hui1，ZHAO Lin-lin1，GUO Yong-ze2，CHENG Yi2，WEN Chun-xiu3
（1．Tianjin High-Standard Quality Testing Lab，Tianjin 300381，China；2.Tianjin Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research Institute，Tianjin 300381，China；3.Institute of Cash Crops，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Science，Shijiazhuang 050051，China）

［Objective］To establish the HPLC/PDA/ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae.［Methods］This experiment had been done on Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）analytical column of 30℃，with a gradient eluted acetonitrile-0.1% acetic acid mobile phase system of 1.0 mL/min.The detection wavelength had been set at 258 nm，N2pressure was 30 Psi，and the temperature of the drift tube was 80℃.［Results］The mutual modes of the HPLC/PDA/ELSD fingerprint were set up under the established condition.The 17 mutual peaks in the HPLC-PDA fingerprint and 14 mutual peaks in the HPLC-ELSD fingerprint of 11 samples were confirmed.［Conclusion］The method that had been established in this experiment is a good method to totally control the quality of Rhizoma Anemarrhenae.

Rhizoma Anemarrhenae；fingerprint；HPLC/PDA/ELSD

R284.1

A

1672-1519（2015）10-0618-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.10.10

“十二五”科技部國家科技支撐計劃項目（2011B A107B064）。

魏靜娜（1981-），女，碩士，工程師，研究方向為藥品質(zhì)量分析。

程奕，E-mail：cychengyi@yahoo.com。

（2015-04-27）