西藏那曲地區(qū)夏季降水中生物冰核的分布特征

杜鵬瑞，杜　睿，路則棟，梁宗敏 （中國科學院大學資源與環(huán)境學院，北京 100049）

西藏那曲地區(qū)夏季降水中生物冰核的分布特征

杜鵬瑞，杜睿*，路則棟，梁宗敏 （中國科學院大學資源與環(huán)境學院，北京 100049）

于2013年6～10月在高海拔的西藏那曲地區(qū)采集雨水樣品，共獲得6月份和7月份兩個有效樣品.通過液滴凍結實驗，對雨水樣品中大于0.22μm的氣溶膠顆粒物的冰核活性進行檢測，同時對不同處理（原樣雨水、濾液、添加蛋白變性劑、加熱煮沸）的雨水樣品的凍結溫度進行檢測.結果顯示，6月份和7月份原樣雨水樣品的平均凍結溫度分別為-13.3℃和-8.7℃.在-10℃以上，雨水樣品中存在對蛋白變性劑和加熱敏感的生物冰核，但不同月份雨水中的生物冰核對雨水液滴的凍結所起的貢獻不同.7月份雨水樣品中的高效生物冰核對液滴在較高溫度下凍結起到主要的催化作用，而6月份雨水樣品中的生物冰核對液滴凍結未起到顯著作用.經0.22μm濾膜過濾的雨水濾液樣品中，仍然存在高效生物冰核，但目前尚未確定其主要成分.通過對雨水樣品中細菌16S rRNA基因和真菌rRNA內轉錄間隔區(qū)及5.8S rRNA的ITS1-5.8S-ITS2基因進行克隆測序分析，獲得西藏那曲地區(qū)夏季6月份和7月份雨水樣品中細菌和真菌的群落組成.發(fā)現微生物群落組成中包含了具有高效生物冰核活性的假單胞菌屬（Pseudomonas）細菌和鐮刀菌屬（Fusarium）真菌.

雨水；生物冰核；細菌；真菌；分布特征

青藏高原作為中國最大的高原，也是全球最高的高原，被譽為“世界屋脊”和“第三極”，經全球熱力學和動力學的輸送，該地區(qū)的降雨和降雪的變化，會影響到全球大氣循環(huán)和水循環(huán)過程［1-2］.大氣中的氣溶膠粒子可以作為云凝結核（CCN）和冰核（IN）影響太陽光的輻射以及云的形成［3-5］，進而影響到降水過程.大氣和云層中的水汽和液態(tài)小水滴可通過同質核化和異質核化兩種途徑形成初始的冰晶.同質核化以水分子構成的集合體為中心，通常在溫度低于-35℃或 300%水汽過飽和度條件下才能凍結形成冰晶［6-7］.在真實大氣環(huán)境中，同質核化并不容易發(fā)生.在溫度高于-35℃時，必須有冰核的存在，水汽和過冷液滴才更易形成冰晶［8-9］，即異質核化.能作為冰核的主要氣溶膠粒子有礦物沙塵［10-11］，煙塵［12］，結晶的鹽粒子［13-14］，以及生物粒子.而在這幾種冰核之中，生物氣溶膠粒子在較高溫度-2℃［15-16］下就能催化液滴形成冰晶，因此被認為是自然界中最有效的冰核.

生物氣溶膠粒子包括細菌、真菌及其孢子、病毒、花粉以及動植物殘片等.已有的研究表明，每年大約有 1000Tg的生物氣溶膠粒子進入大氣［17］，細菌有0.4～28.1Tg，真菌有8～186Tg.細菌氣溶膠粒子的直徑在1μm左右，真菌氣溶膠粒子的直徑在 2～10μm［18］，這對于其作為冰核催化小液滴形成冰晶非常有利.目前，國內外已分離出并得到普遍認可的具有冰核活性的細菌主要分布于假單胞菌屬（Pseudomonas）、歐文氏菌屬（Erwinia）和黃單胞菌屬（Xanthomonas），具有冰核活性的真菌主要是鐮刀菌屬（Fusarium）真菌和一些共生的地衣真菌［15，19-22］.對于其他屬的細菌和真菌而言，基本不具備高效生物冰核活性.我國科研人員自20世紀80年代開始對生物冰核的種類及其作用機理進行研究，目前已經從植物、昆蟲和土壤中分離出多株冰核活性細菌、真菌［21，23］.已有的研究多側重生物冰核對植物造成的霜凍災害，以及利用其特性進行促凍殺蟲和人工造雪，但對于生物冰核在大氣降水過程中的作用，則研究得相對較少［24-26］.

生物冰核是一類可以在-10℃以上較溫暖的條件下催化過冷卻水形成冰晶［27］的粒子.1957年法國氣象學家在云室實驗中，首次發(fā)現霉菌孢子可以作為冰核催化液滴形成冰晶，之后 Schellt等［28］指出大氣中部分冰核可能是由生物引起的.自此，越來越多的生物冰核從大氣顆粒物、云滴和雪中分離出來［18，29］.在液滴凍結實驗中，生物冰核使全部液滴凍結的平均溫度在-10℃以上，而已知的非生物高效冰核則在-10℃以下.但并非所有的生物氣溶膠粒子都可以作為生物冰核.已知的大多數細菌和真菌并不能在-10℃以上催化液滴凍結，因此不能被稱為生物冰核，而只能夠作為生物類的普通冰核存在于大氣中.即使已經被證明具有冰核活性的細菌和真菌等生物冰核，由于菌體濃度和生長環(huán)境等條件的影響，導致在-10℃以上不能催化液滴凍結，未能表現出生物冰核效應［30-31］.科學家們已經從云層、雨水和霜凍植物等眾多環(huán)境樣品中分離出生物冰核.一些學者認為生物冰核分布廣泛，數量眾多，在大氣降水形成過程中發(fā)揮著重要作用［29，32-35］，但也有學者對此持不同觀點，認為生物冰核在降水過程中的作用非常微弱［36-37］.生物冰核高效的核化機制已經被研究確認：冰核生物含有冰核基因，其表達形成的冰核蛋白具有高效的成冰活性［38］.但由于無法確認真實大氣環(huán)境中是否有足夠數量的生物冰核來激發(fā)催化冰晶的形成，使生物冰核在成云和降水過程中的貢獻大小成為了當前生物氣溶膠研究中爭論的焦點之一.

國內關于青藏高原地區(qū)降雪、凍土、冰芯以及其中的微生物群落多樣性與當地環(huán)境及氣候變化適應關系的研究較多［39-42］，但尚未有關于生物冰核在當地降水過程中作用的研究.本研究通過對西藏那曲地區(qū)夏季雨水的液滴凍結溫度和其所含的冰核數量進行檢測，同時對雨水中的微生物群落組成進行分析，以此來探究生物冰核在西藏夏季雨水中的分布特征和變化，進而探討其在雨水形成過程中可能的貢獻.

1　材料與方法

1.1采樣點介紹

降水樣品的采集地點位于中國科學院青藏高原研究所那曲生態(tài)環(huán)境綜合觀測研究站.該站位于那曲縣羅馬鎮(zhèn)，地處唐古拉山脈與念青唐古拉山脈之間的那曲河流域，海拔4450m.該地區(qū)氣候類型為高原亞寒帶季風半濕潤氣候，下墊面為高寒草甸.年平均氣溫-2.1℃，全年降水大約400mm，多集中在6～9月，年平均相對濕度51%.

1.2降水樣品的采集與過濾

雨水樣品采集使用的是容積為3L的玻璃燒杯，為了增加接雨面積，專門制作了直徑為燒杯直徑2倍的不銹鋼接雨器，在接雨時加裝在燒杯口部.在降雨之前，用無菌去離子水對燒杯、不銹鋼接雨器以及過濾雨水時要用到的過濾裝置進行充分清洗，然后包裹上醫(yī)用無紡布，在 121℃高溫條件下滅菌 20min.降雨開始后，將多個加裝不銹鋼接雨器的玻璃燒杯置于空曠區(qū)域收集雨水.由于該地域空曠，常年大風，為保障實驗所需雨水量，雨水樣品是實驗采樣月份中多次收集雨水的混合.每次收集樣品時間不超過 12h，所接雨水立即放入 4℃冰箱密封保存.降水樣品采集時間為2013年6～10月，但由于8月、9月和10月降水較少且受到大風影響，收集的雨水不足以做相關實驗，因此只得到6月和7月兩個有效的雨水樣品，編號分別為XZ6和XZ7.采用真空抽濾泵（津騰公司）和硝酸纖維素膜（孔徑 0.22μm，直徑47mm，Millipore USA）對雨水樣品進行過濾，每張濾膜過濾雨水量為500mL，每個月份的雨水樣品共過濾兩張濾膜.隨即將濾膜彎曲裝入無菌的50mL離心管中，保存于冰箱-20℃冷凍室，以備后續(xù)分析測試.另外，分別取原樣雨水和過濾后的雨水濾液裝入無菌的50mL離心管中，保存于4℃冰箱，以備后續(xù)分析.

1.3樣品處理

1.3.1雨水和濾膜上顆粒物的處理從-20℃冰箱中取出裝有硝酸纖維素濾膜的 50mL離心管，向其中加入滅菌的去離子水30mL，淹沒濾膜.用無菌玻璃棒輕劃濾膜，使其上面的顆粒物進入去離子水中，再加入 20mL無菌去離子水到離心管中，蓋上蓋子后振蕩離心管，盡可能使膜上的所有顆粒物被重新洗入去離子水中.與原樣雨水相比，該處理使雨水中大于 0.22μm的顆粒物（過濾時被截流在濾膜上）的濃度提高了約 10倍.分別取3管原樣雨水（A1，A2，A3），3管過濾后的雨水濾液（B1，B2，B3），3管洗膜的雨水顆粒物重懸液（C1，C2，C3），每管10mL，分為A，B，C三組.分別向第二組樣品A2，B2，C2中加入200uL的苯酚+氯仿+異戊醇（比例為 25∶24∶1）的混合溶液，目的是使溶液中的蛋白質變性.對第三組樣品A3，B3，C3進行水浴加熱，在 100℃條件下水浴5min，使蛋白質在高溫條件下變性失活.根據生物冰核的高效冰核活性來源于冰核蛋白的機理，樣品中所含的生物冰核經上述兩種處理后會失去其部分或全部的高效核化活性.

1.3.2雨水中微生物 DNA的提取與測序從 -20℃冷凍室中取出濾膜，在超凈工作臺中用剪刀將濾膜剪碎，盛于無菌的培養(yǎng)皿中.用無菌鑷子夾取剪碎的濾膜裝入 FastDNA SPIN Kit for soil（MP Biomedicals USA）提供的離心管中，然后按照試劑盒說明進行微生物總 DNA的提取.DNA提取成功后，以DNA為模板，采用細菌通用引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），擴增細菌16S rRNA基因片斷.采用真菌通用引物ITS1f （5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS4 （5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），擴增真菌rRNA上的ITS1-5.8S-ITS2基因片斷.PCR反應條件及后續(xù)的克隆轉化與測序等相關實驗詳見文獻［43］.

1.4雨水中生物冰核的檢測

采用中國氣象科學研究院楊紹忠等［44-45］所研制的凍結核含量檢測裝置對雨水液滴的凍結溫度和雨水中的冰核數量進行檢測.按照裝置使用說明，先用丙酮清洗實驗臺上每個感應件的表面，然后滴加憎水膠膜（防止不同組次實驗的相互污染并維持一個相對干凈的本底），待其揮發(fā)蒸干后形成一個邊緣明顯的圓斑.使用移液槍在圓斑上滴加 10μL的小液滴，蓋上實驗臺蓋子，按照2℃/min的速率進行均勻降溫.從0℃開始，傳感器和檢測器開始記錄數據，每有一個液滴凍結，就會記錄一個信號，最后會得出各個溫度下凍結液滴的個數.每個樣品進行5次重復測試，使測試結果中的有效數據保持在200個以上，從而保障實驗測試結果的科學性.在對雨水各個處理樣品進行檢測的同時，采用娃哈哈瓶裝純凈水作為對照，檢測其平均凍結溫度.

1.5數據處理

1.5.1冰核數據處理根據Vali［46］的研究，在每個溫度下凍結的液滴個數確定后，可以根據這些數據計算出測試樣品的平均凍結溫度以及每個溫度下累積的冰核數.本文采用公式 K（θ）= ［ln（N0）-lnN（θ）］/V對雨水中各個溫度下累積冰核的濃度進行計算.式中：K（θ）是待測溶液液滴中凍結核的累積濃度；N（θ）是當溫度為θ時，待測液滴中尚未凍結的液滴數量；N0則是待測液滴的總數量；V是單個液滴的體積，cm3.

1.5.2測序數據處理測序得到 16S rRNA序列和ITS1-5.8S-ITS2序列，采用Mallard軟件對其中的嵌合體進行檢測去除.剩余序列采用Mothur（www.mothur.org/）軟件，細菌按照相似性不小于 97%的序列劃分為同一個 OTU （Operational Taxonomic Units）的原則進行分類，真菌按照相似性不小于 99%的序列劃分為同一個OTU的原則進行分類，同時給出每個OTU的代表序列和每個樣品（XZ6，XZ7）的群落多樣性指數（Shannon’s diversity indices，H），物種豐度（species richness，Chao1），稀有度曲線（rarefaction curves）與覆蓋率（coverage）.將得到的每一個OTU的代表序列放到 Genbank中的 NCBI Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中進行比對，如果代表序列與數據庫中的參比序列相似度達到97%以上，在分類學上就歸為同一個屬，因此可以根據數據庫中相似序列的種屬分類確定每個OTU中序列的分類歸屬.

2　結果與討論

2.1生物冰核檢測

根據生物冰核的定義［27］，以溫度高于-10℃時液滴凍結來判斷生物冰核的存在.兩個月份原樣雨水樣品 A1的平均凍結溫度分別是-13.3℃和-8.7℃（圖1）.因此可以確定7月份雨水樣品中存在生物冰核，且其在雨水液滴凍結中起到主要作用.雨水濾液樣品B1與A1相比，平均凍結溫度有微小降低.兩個月份 B1的平均凍結溫度分別是-14.4℃和-10.3℃.作為對照的娃哈哈瓶裝純凈水的平均凍結溫度為-17.5℃和-17.7℃，低于濾液B1.濾液B1是A1經過0.22μm的硝酸纖維素濾膜過濾得到的，其中的生物與非生物冰核都有所減少，但7月份雨水濾液樣品B1的平均凍結溫度依然接近-10℃，遠高于純凈水的-17℃.由于生物冰核能在較高溫度下催化液滴凍結的機理［38，47-51］是其具有冰核基因，冰核基因經過轉錄、翻譯和加工后，在細胞膜表面形成具有一定結構的冰核蛋白［50，52-53］，因此7月份濾液B1的平均凍結溫度接近-10℃，可能是因為過濾過程中一部分冰核蛋白脫離菌體進入濾液或濾液中含有類似于冰核蛋白且具有高效核化活性的未知物質.洗膜的顆粒物懸浮液C1與A1相比，平均凍結溫度提高到-9.4℃和-8.0℃，顯示雨水顆粒物中的確存在高效冰核.生物冰核效應與生物冰核的濃度有很大的關系［30］，只有生物冰核達到一定濃度后，才能使液滴的平均凍結溫度達到-10℃以上.C1處理對雨水中大于0.22μm的顆粒物濃度進行了10倍左右的濃縮，同時已知的非生物冰核使液滴凍結的平均溫度均在-10℃以下，因此凍結溫度的顯著增高可能是生物冰核濃度增加引起的.大氣中的微生物一般多黏附在顆粒物表面，雨水中大于 0.22μm的顆粒物的濃度提高，會使生物冰核的濃度同時得到提高，從而生物冰核效應增強，液滴的平均凍結溫度升高.楊紹忠等［44］采用相同的凍結核檢測裝置，測得北京地區(qū)的冰雹融化水和雨水的平均凍結溫度在-12.1℃到-16.17℃，其結果與本研究 6月份雨水樣品的平均凍結溫度接近，但明顯與低于7月份雨水的平均凍結溫度.王亞玲等［30］采用 Pseudomonas syingae冰核細菌菌懸液進行實驗，菌液濃度高于105cells/mL時，液滴的平均凍結溫度高達-5℃，但菌液濃度降低時，其平均凍結溫度明顯降低，低于-10℃.6月份雨水樣品A1與C1的差異，就是由于生物冰核濃度的不同引起的.

添加蛋白變性劑（苯酚、氯仿、異戊醇混合液）的第二組樣品 A2，B2，C2和加熱煮沸處理的第三組樣品A3，B3，C3中的冰核蛋白因蛋白變性劑和受熱發(fā)生變性，從而抑制生物冰核的核化活性，與未做相應處理的樣品相比，加入蛋白變性劑和加熱煮沸降低了液滴的平均凍結溫度.由于非生物類冰核對蛋白變性劑和加熱不敏感，因此西藏夏季雨水樣品中一定存在生物冰核.當它們經過蛋白變性劑和加熱處理后，其核化活性受到破壞或者抑制，造成了液滴平均凍結溫度的降低.與雨水樣品 C1相比，進行蛋白變性處理的雨水樣品C2，C3的液滴平均凍結溫度降低了0.3～3.3℃，但均高于做相同蛋白變性處理的雨水樣品A2，A3的平均凍結溫度.這可能是因為蛋白變性劑和加熱處理并未完全抑制生物冰核的活性.表1給出了蛋白變性劑和加熱煮沸處理對生物冰核的破壞程度.7月份雨水樣品C2，C3的平均凍結溫度依然在-10℃以上，6月份雨水樣品中的C2的平均凍結溫度也接近-10℃，這再次表明經處理后部分生物冰核仍保持活性.

圖1　不同處理的雨水樣品的平均凍結溫度Fig.1　Average freezing temperatures of rain water under different treatments

圖2顯示，當溫度降到-10℃時，不同處理樣品測試液滴中所檢測到的累積冰核數目.假定在這個溫度下累積的冰核都是生物冰核，則兩個月份的原樣雨水樣品 A1中都存在生物冰核，但它們的平均凍結溫度卻存在較大的差異，6月份為-13.3℃，在-10℃以下，7月份為-8.7℃，在-10℃以上.這是因為6月份雨水樣品中所含生物冰核數量較少，對浸潤模式下液滴的全部凍結所起的作用不大.7月份雨水樣品中含有大量的生物冰核，液滴凍結主要由其催化引起.這也證明了由于生物冰核濃度大小的差異，使得生物氣溶膠在大氣降雨過程中的貢獻存在較多的不確定性.由表 1可知，除7月份雨水顆粒物濃縮樣品的加熱處理C3外，其他測試樣品的加熱處理都使生物冰核在-10℃的累積量減少 85%以上.蛋白變性劑對生物冰核的影響差異較大.在-10℃條件下，生物冰核的減少量在3.44%到87.05%之間變化.

值得注意的是，與雨水樣品B1相比，雨水樣品B2和B3的平均凍結溫度以及在-10℃累積的冰核數目都有所降低.7月份雨水樣品中的B3比 B1的平均凍結溫度降低了4.6℃，6月份雨水樣品中的 B3在-10℃累積的冰核數目比B1減少了100%.由于經過孔徑為 0.22um的硝酸纖維素膜過濾，B1中含有完整的且具有高效冰核活性的細菌和真菌的比例很低，但其在-10℃以上仍顯示有冰核的存在.加入蛋白變性劑和加熱煮沸處理后，B2和B3在-10℃的冰核數減少.因此，可以推測濾液B1中對蛋白變性劑和加熱煮沸處理敏感的冰核具有一定的生物活性，它或是冰核蛋白及其殘片，或是病毒，亦或是目前還未認知的某種新的生物冰核. Christner等［29，32］分別采用蛋白酶及加熱處理對雨水和雪水中的生物冰核進行處理，其實驗結果顯示，加入蛋白酶破壞冰核蛋白后，各樣品在-9℃以上累積冰核的減少量在25%～64%，而進行加熱處理使蛋白變性后，各樣品在-9℃累積冰核的減少量在 69%～100%，這與本研究結果基本類似.

圖2　在溫度-10℃時的累積冰核數Fig.2　Cumulative number of Ice Nuclei at the temperature of -10℃

綜合以上結果，同時根據生物冰核的定義，可以認定那曲地區(qū)夏季降雨中確實存在生物冰核，但這部分生物冰核是來自于降水形成過程中的云內清除還是來自于云下清除尚不確定.如果來自于云內清除過程，生物冰核就可能在降水的形成過程中起到一定的作用，但如果來自于云下清除過程，則無法確定其在降水形成過程中的影響，另外一種可能則是兩種過程并存.

表1　蛋白變性劑和加熱煮沸對生物冰核活性的影響（%）Table 1　The effects of Protein Denaturants and Boiling on the activities of Biological Ice Nuclei （%）

表2　克隆文庫各項指標評估Table 2　Assessment for indicators of the clone libraries

2.2測序基因文庫指標分析

對雨水中微生物的基因測序結果進行去雜、去嵌合體后，細菌16S rRNA基因序列構成的克隆文庫為：XZB6（56個有效克隆子），XZB7（129個有效克隆子），真菌 ITS1-5.8S-ITS2基因序列構成的克隆文庫為：XZF6（59個有效克隆子），XZF7（66個有效克隆子）.表2給出4個克隆文庫的基本指標數據，樣品測序結果的覆蓋率在77%～92%，已能夠覆蓋樣品中主要的細菌和真菌種群.7月份雨水中細菌的物種豐度（Chao1指數）是6月份雨水中的4倍，7月份雨水中真菌的物種豐度是6月份雨水中的2倍左右，由此可見，西藏6月份與7月份的雨水樣品中物種數目存在較大差異，7月份雨水中的細菌和真菌物種數明顯高于 6月份雨水.兩個月份中，細菌群落的多樣性指數（Shannon指數）差異不大，但真菌的群落多樣性指數有明顯的差異，這與群落中物種的數目和每個物種所占比例有關，6月份雨水中的真菌大多屬于同一類.由于大氣中的微生物主要來自于地面植被、土壤和人為的排放，因此以上群落的差異可能是由于降雨前人為活動（如放牧）或自然活動（風）的影響，也可能是由于地面植被不同生長階段的變化.另外，降雨形成過程涉及到大氣循環(huán)以及其中物質的傳輸與變化，這也會引起群落組成的差異

2.3群落結構組成

2.3.1細菌群落結構分析將克隆文庫中每個OTU的代表序列放入NCBI中進行Blast比對的結果顯示，共得到14個屬的細菌（圖3）.6月份雨水樣品中的細菌主要屬于變形菌門和放線菌門，分別占89.3%和8.9%.7月份雨水樣品中的細菌包括三個門，所占比例分別為變形菌門占58.1%，放線菌門占3.8%，厚壁菌門占32.5%.兩個月份的雨水樣品中，有一種共同的優(yōu)勢屬細菌，即β變形菌綱的 Massilia屬，它在兩個月份中的比例分別為37.2%和67.8%.另外，6月份雨水樣品中的優(yōu)勢菌屬還有γ變形菌綱的Acinetobacter屬（12.5%）和放線菌門的Arthrobacter屬（8.9%）.7月份雨水樣品中的優(yōu)勢屬還有 β變形菌綱的 Variovorax屬（7.8%）和厚壁菌門的Exiguobacterium屬（32.6%）.與生物冰核相關的Pseudomonas屬細菌卻僅在6月份的雨水樣品中發(fā)現，而且所占比例非常低，僅占細菌克隆總數的1.8%.

2.3.2真菌群落結構分析圖4顯示，6月份雨水樣品中能明確分類到屬的真菌僅有兩種，分別是擔子菌門的隱球菌屬（Cryptococcus）和子囊菌門的短梗霉屬（Aureobasidium），隱球菌屬占有絕對的優(yōu)勢，所占比例為94.9%. 7月份雨水樣品中的真菌種類相對豐富，共有9個屬的真菌被確定出來，分別為子囊菌門的莖點霉屬（Phoma），地絲菌屬（Geomyces），德巴利氏酵母屬（Fusarium），鐮刀菌 屬（Fusarium），擔子菌 門的鬼傘 屬（Coprinopsis），白冬孢酵母屬（Leucosporidium），隱球菌屬（Cryptococcus），黑粉菌屬（Ustilago），另外還鑒定出一種非真菌門類而屬于綠藻門的蕨藻屬（Caulerpa）.隱球菌屬（Cryptococcus）真菌在 7月份的雨水樣品中依然屬于優(yōu)勢菌屬，但所占比例降低到 36.4%.另一種地絲菌屬（Geomyces）真菌比它更加豐富，所占比例是 45.5%.在兩個月份的雨水樣品中，僅在7月份發(fā)現與生物冰核相關的鐮刀菌屬（Fusarium）真菌，所占比例為3.0%.

圖3　細菌群落結構組成（屬水平）Fig.3　Bacterial community structures （the level of genus）

2.3.3與其他生境條件微生物群落組成的比較同一個地區(qū)，不同生境條件下，微生物的群落組成會有不同，這些差異能夠反應出不同生境的獨特環(huán)境條件以及功能.青藏高原地區(qū)降水中的微生物群落組成與本地區(qū)的冰川、湖泊、土壤中的微生物群落組成存在一定的相似性和差異性.在門的分類水平上，青藏高原地區(qū)廣泛存在放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的細菌［54-57］，不同生境的相似性較高，但在屬水平上的差異卻很明顯.例如，那木錯湖水中的Hydrogenophaga屬細菌占有絕對的優(yōu)勢［55］，而在雪樣中，Sphingomonas屬和Polaromonas屬細菌較為常見［56］.雖然雨水中的各屬細菌在青藏高原其他生境中均有所發(fā)現，但在群落組成和優(yōu)勢物種等方面的差異仍然較大［56，58-59］.土壤、湖泊以及積雪中的微生物與當地環(huán)境的關系非常緊密，所反映出的變化趨勢更側重長期效應，而本研究采集的降水樣品中的微生物可能是隨著大氣環(huán)流從其他地方輸送而來，也有可能再次被輸送到其它區(qū)域.因此降水中微生物的組成很可能與當地其他環(huán)境中微生物群落存在較大的差異.

2.4微生物群落組成與液滴凍結的關系

6月份和7月份雨水樣品中的微生物群落組成表明，6月份雨水樣品中存在與生物冰核相關的假單胞菌屬（Pseudomona）細菌，7月份雨水樣品中存在與生物冰核相關的鐮刀菌屬（Fusarium）真菌，但兩者在群落中所占的比例都較低.除上述兩種生物冰核外，尚未發(fā)現其它已得到公認的生物冰核種類.根據液滴凍結實驗數據，蛋白變性劑和加熱處理使雨水原液A1在-10℃累積冰核數減少，因此我們確定兩次雨水樣品中都存在生物冰核.但其對全部液滴的凍結所起的作用有所差異，7月份A1的平均凍結溫度為-8.7℃，生物冰核在雨水液滴凍結中起主要作用，6月份雨水液滴凍結平均溫度為-13.3℃，凍結過程中起主要作用的是非生物冰核.本研究中使用的克隆測序技術能夠分析得出優(yōu)勢菌群，當生物冰核在大氣環(huán)境中不占優(yōu)勢時，可能檢測不到全部種類的冰核生物.此外，冰核細菌不同變種之間的冰核活性存在較大差異，很難根據測序數據在種水平上對細菌、真菌等生物冰核進行鑒定.即使鑒定出具有冰核活性的細菌種類，因其冰核活性的表達受到許多外界條件的制約，只有滿足這些條件，比如需要低溫誘導冰核蛋白的表達，需要一定的生物冰核濃度等，才能在-10℃以上起到冰核催化作用.因此，在研究生物冰核的分布及其作用時，可以通過測序或培養(yǎng)的方法尋找具有生物冰核活性的微生物，但更重要的是通過凍結溫度的測試來鑒定生物冰核的存在及其作用強度.

3　結論

3.1西藏那曲地區(qū)，夏季6月份和7月份的雨水樣品中都存在生物冰核.6月份原樣雨水中生物冰核的量較少，在全部液滴凍結中未起到主要作用.7月份原樣雨水中生物冰核的量較大，對全部液滴凍結起到了主要作用.

3.2西藏那曲地區(qū)夏季不同月份雨水中生物群落組成存在差異.兩個月份的雨水中共發(fā)現3個門類14個屬的細菌，3個門類10個屬的真菌.夏季雨水樣品中發(fā)現含有生物冰核的假單胞菌屬（Pseudomona）細菌和鐮刀菌屬（Fusarium）真菌.雨水液滴凍結檢測結果顯示，雨水中的生物氣溶膠具有一定的高效冰核活性.

3.3經 0.22μm過濾得到的雨水濾液中依然存在生物冰核，但其成分尚未得到確定，還需在以后的研究中進一步探明其屬性.

3.4雨水中檢測到的生物冰核來自于云內清除還是云下清除存在不確定性，生物冰核在大氣降水形成過程中所做貢獻的大小還有待商榷.

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致謝：真誠感謝中國科學院青藏高原研究所那曲生態(tài)環(huán)境綜合觀測研究站的全體工作人員在采樣過程中所提供的幫助.

Distribution of biological ice nuclei in the summer precipitations of Naqu in Tibet.

DU Peng-rui，DU Rui*，LU Ze-dong，LIANG Zong-min （College of Resource and Environment，University of Chinese Academy of Science，Beijing 100049，China）.

China Environmental Science，2015，35（7）：1998～2006

Precipitation sampling was took at Naqu of Tibet from June to October，2013. Only two valid rainwater samples in June and July were got. With the experiments of droplets freezing，the average frozen temperature of droplets embedded with particulate matters （＞0.22μm） of rainwater samples were tested. Meanwhile，the activity of ice nuclei in the original rainwater，filtered rainwater，rainwater added with protein denaturants，boiled rainwater had also been tested. The results indicated that the average freezing temperatures of original rainwater droplets in June and July were -13.3℃and -8.7℃，respectively. As for samples with the average freezing temperatures above -10℃，it can be concluded that there were some biological ice nuclei in the original rainwater，which were sensitive to the protein denaturants and boiling. However，their nucleation activities were different for these two months. The biological ice nuclei played a major role in the freezing of droplets in July，but not in the June. The filtered rainwater still contained efficient biological ice nuclei，but the compositions were still unknown. Using the cloning and sequencing technology，the bacteria 16S rRNA gene and the fungi ITS1-5.8S-ITS2 gene that covered the two internal transcribed spacer and 5.8S rRNA gene were analyzed. The results indicated that the bacterial genus of Pseudomonas and the fungal genus of Fusarium were recovered in the rainwater and they were supposed to be two types of efficient biological ice nuclei.

rainwater；biological ice nuclei；bacteria；fungi；distribution

X172

A

1000-6293（2015）07-1998-09

2014-12-15

國家自然科學基金資助項目（41175135）

* 責任作者，副教授，ruidu@ucas.ac.cn

杜鵬瑞（1988-），男，河南鄭州人，中國科學院大學博士研究生，主要從事生物氣溶膠研究.