海水養(yǎng)殖漁用抗生素有效含量及其抑菌效果比較研究

趙　莉，施　慧，李佩佩，王庚申，謝建軍，許文軍

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山　316021；2.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山　316022）

海水養(yǎng)殖漁用抗生素有效含量及其抑菌效果比較研究

趙莉1，2，施慧1，李佩佩1，王庚申1，謝建軍1，許文軍1

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山316021；2.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山316022）

為了對(duì)浙江常見海水養(yǎng)殖漁用抗生素的殺菌效果進(jìn)行比較分析，本研究首先采用高效液相色譜法（HPLC）和超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（ΜPLC-ESI-MS/MS）對(duì)8種常見的漁用喹諾酮類抗生素及5種氟苯尼考藥物的有效成分含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果:13種漁藥的實(shí)際有效成分含量與標(biāo)示含量不符的現(xiàn)象較為突出：8種喹諾酮類藥物中只有4種藥物的有效成分含量與標(biāo)示含量基本一致，其它均低于標(biāo)示含量，其中含量最低的只有標(biāo)示值的59.2%；5種氟苯尼考類藥物中3種藥物的有效成分含量與標(biāo)示含量基本一致，其余2種有效含量?jī)H為標(biāo)示值的25%。同時(shí)，本研究運(yùn)用液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法對(duì)上述抗菌藥物開展了針對(duì)常見海水致病菌——溶藻弧菌MIC和MBC的測(cè)定，結(jié)果：喹諾酮類藥物的MIC和MBC值介于2.28～18.94 mg/L之間；氟苯尼考漁藥的MIC和MBC值介于0.022～4.48 mg/L之間，其中溶液型氟苯尼考的MIC和MBC值較低，均為0.022 mg/L，表明所測(cè)的幾種喹諾酮類和氟苯尼考藥物均對(duì)受試菌敏感。

喹諾酮；氟苯尼考；高效液相色譜法；超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法；最小抑菌濃度；最小殺菌濃度

細(xì)菌性疾病是危害海水養(yǎng)殖業(yè)的一類主要病害，每年給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。藥物防治是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病防控采取的重要手段之一，由于當(dāng)前漁藥市場(chǎng)的產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，養(yǎng)殖戶難以對(duì)藥物準(zhǔn)確用量形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，所以造成了水產(chǎn)養(yǎng)殖中亂用、濫用漁藥的現(xiàn)象。漁藥的亂用、濫用不僅造成了細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)的后果，同時(shí)也威脅到了養(yǎng)殖環(huán)境穩(wěn)定和水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。為了對(duì)漁用抗生素的殺菌效果進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)價(jià)以規(guī)范水產(chǎn)養(yǎng)殖中正確使用漁藥，本文對(duì)市售漁藥的有效成分含量及體外殺菌效果開展了研究。通常藥物有效成分含量可以通過滴定法，可見-紫外分光光度法，免疫學(xué)方法，電泳法等方法來測(cè)定［1-3］，近年來隨著分析儀器的迅速發(fā)展，儀器分析在藥物研究上應(yīng)用越來越廣泛，其中色譜分析法就以高分離效能、高檢測(cè)性能、分析快速的特點(diǎn)，成為現(xiàn)代儀器分析方法中應(yīng)用最廣泛的一種方法［4-7］。本研究運(yùn)用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)市售不同廠家的恩諾沙星和諾氟沙星共計(jì)8種抗菌藥物進(jìn)行了有效成分含量檢測(cè)；運(yùn)用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-ESI-MS/MS）對(duì)不同廠家生產(chǎn)的氟苯尼考共計(jì)5種抗菌藥物進(jìn)行了有效成分含量檢測(cè)。

藥物的體外抗菌試驗(yàn)是抗菌藥物對(duì)細(xì)菌抵抗力的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)也是驗(yàn)證抗菌藥物效果的重要依據(jù)。肉湯稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法是藥物體外抑菌試驗(yàn)最常用的方法，其中稀釋法有液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法和固體稀釋法（斜面法）兩種，藥物的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）可以通過這兩種方法來測(cè)定。本研究采用了液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法對(duì)不同廠家恩諾沙星、諾氟沙星及氟苯尼考共計(jì)13種抗菌藥物進(jìn)行了MIC和MBC的測(cè)定。

1　材料與方法

1.1藥物和菌株

本文共選取了浙江主要海水養(yǎng)殖區(qū)常用不同廠家的抗菌藥物恩諾沙星、諾氟沙星及氟苯尼考等3類抗菌藥物共計(jì)13種市售漁藥（表1）。

試驗(yàn)用菌株為常見海水致病菌——溶藻弧菌，由浙江省淡水水產(chǎn)研究所沈錦玉老師惠贈(zèng)。

表1　抗菌藥物種類Tab.1　Types of antibiotics

1.2喹諾酮類藥物的有效成分測(cè)定

恩諾沙星和諾氟沙星諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取諾氟沙星、氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用0.1 mol/L HCL溶液10 mL溶解，再用乙腈定容于100 mL棕色容量瓶中，此溶液質(zhì)量濃度為100 μg/mL，于4℃保存?zhèn)溆?；根?jù)檢測(cè)要求用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成0.01、0.02、0.05、1.00、2.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以各組分的色譜峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作線性回歸，得定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

藥物樣品制備：精密稱取待測(cè)藥品約10 mg，置于25 mL容量瓶中，用適量0.1 mol/L的鹽酸溶液使之溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。再精取上述液體20 μL，用乙腈稀釋至10 mL供氣相色譜測(cè)定用。

液相色譜檢測(cè)條件：色譜柱為Water X Bridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μM）；流動(dòng)相為四丁基溴化銨（A）+乙腈（B），A∶B=96%∶4%；流速為0.8 mL/min；柱溫為40℃；檢測(cè)器為Waters 2475熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

1.3氟苯尼考有效成分測(cè)定

氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取適量純度大于98%的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備原液，-18℃避光保存；準(zhǔn)確吸取1.0 mL氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備原液，用甲醇稀釋并定容至100 mL，配成1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃避光保存。移取儲(chǔ)備液用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成0.25、0.50、10.0、20.0、50.0 ng/mL的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，得定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品制備：準(zhǔn)確稱取待測(cè)藥品約20 mg，置于25 mL容量瓶中，用適量0.05 mol/L的鹽酸溶液使之溶解，用水稀釋至刻度，搖勻。再精取上述液體20 μL，用水稀釋至1 mL，再取第一次稀釋液20 μL，用水稀釋至1 mL，供液相色譜-聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

液相及質(zhì)譜檢測(cè)條件：色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 rnm×50 mm，1.7μM）；流動(dòng)相：是冬季溴化銨（A）+甲醇（B）；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。

子化模式：電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：3.50 kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；駐留時(shí)間：0.15 s。

將標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品液等體積進(jìn)樣測(cè)定，記錄保留時(shí)間和峰面積。用Masslynx V4.1工作站對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到樣品制備液的實(shí)際測(cè)定濃度。

1.4抗菌藥物MIC測(cè)定

1.4.1漁藥原液的制備

根據(jù)藥物包裝所示含量，按照公式計(jì)算所需稀釋劑用量，用分析天平精確稱取抗生素粉劑，使配制的抗菌藥物貯存液濃度10倍于最高測(cè)定濃度，然后將抗生素粉劑溶解于稀釋劑中。

1.4.2菌懸液的制備

挑取細(xì)菌培養(yǎng)基上單菌落，滿板劃線接種于TSA平板，28℃培養(yǎng)24 h，用0.01 M磷酸鹽緩沖液洗下培養(yǎng)的菌苔，校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含2×108CFU/mL。

1.4.3最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

取滅菌試管（13×100 mm）13支，排成一排并編號(hào)，在第1管中加入1.6 mL TSB培養(yǎng)液，剩余每管加入TSB 1 mL；在第1管中加入抗菌藥物原液0.4 mL混勻，然后吸取1 mL至第2管，混勻后再吸取1mL至第3管，連續(xù)倍比稀釋至第11管，從第11管中吸取1 mL棄去，第12管為不含藥物的空白對(duì)照，使各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的菌懸液各1 mL，使第1管至第11管的藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125 μg/mL，每個(gè)濃度做3個(gè)平行組，將接種好的稀釋管，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后肉眼觀察。以最低藥物濃度管中無細(xì)菌生長(zhǎng)者，為受試菌的MIC。

從MIC測(cè)定中未有細(xì)菌生長(zhǎng)的試管中取100 μL培養(yǎng)液，在TSA平板上涂布均勻，設(shè)3個(gè)平行對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)，24 h后觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)，以無菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MBC。

2　結(jié)果

2.1喹諾酮類藥物有效成分含量檢測(cè)結(jié)果

喹諾酮類藥物是水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中使用最廣泛的藥物，本研究中采用了2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的HPLC法［8］，對(duì)市售8種不同商品名的喹諾酮類藥物進(jìn)行了有效成分含量測(cè)定，結(jié)果按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。檢測(cè)結(jié)果顯示，5種恩諾沙星類漁藥中只有1種藥物含量達(dá)到包裝所示含量，其余4種均低于所標(biāo)含量，最低只有標(biāo)識(shí)含量的59.2%，其它在71.2%～83.2%之間。3種諾氟沙星類漁藥含量為標(biāo)識(shí)含量的77.2%～100%（圖1、表2）。

圖1　諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1　Standard wording curve of Norfloxacin

圖2　恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖Fig.2　Standard wording curve of Enrofloxacin

圖3　恩諾沙星和諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（1 μg/mL）Fig.3　Chromatogram of Standard sample of Enrofloxacin and Norfloxacin（1 μg/mL）

圖4　實(shí)際樣品檢測(cè)色譜圖Fig.4　Chromatogram of samples

表2　喹諾酮類藥物的有效含量測(cè)定結(jié)果Tab.2　The effective content of quinolone by HPLC

2.2氟苯尼考藥物有效成分含量檢測(cè)結(jié)果

共檢測(cè)了5種不同品牌市售氟苯尼考類漁藥，其中三種藥物檢測(cè)含量與藥物包裝標(biāo)示含量基本一致，而有兩家含量只有包裝所示含量的25%。最佳質(zhì)譜條件和色譜條件下，氟苯尼考藥物標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和UPLC-ESI-MS/MS色譜圖及樣品MRM色譜圖（圖5～7），有效成分含量（表3）。

圖5　氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)曲線線性圖Fig.5　Standard wording curve of FLR

圖6　氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Fig.6　MRM chromatogram of FLR standard solution（2.00 ng/mL）

圖7　氟苯尼考藥物樣品測(cè)定MRM色譜圖Fig.7　MRM chromatogram of Florfenicol samples

表3　氟苯尼考類藥物有效成分含量Tab.3　The effective content of florfenicol by UPLC-ESI-MS/MS

2.3MIC與MBC檢測(cè)結(jié)果

所檢測(cè)的13種常用水產(chǎn)藥物，其MBC/MIC值均為1，并且對(duì)常見海水致病菌—溶藻弧菌都表現(xiàn)出了較高的敏感性：8種喹諾酮類藥物對(duì)該菌的MIC和MBC值介于2.28～18.94 mg/L之間；5種氟苯尼考類漁藥對(duì)受試菌的MIC和MBC值介于0.022～4.48 mg/L之間，其中溶液型氟苯尼考的MIC和MBC值較低，都為0.022 mg/L，顯示對(duì)受試菌敏感性表現(xiàn)最高（表4）。

表4　抗菌藥物對(duì)溶藻弧菌的MIC和MBCTab.4　The MIC and MBC values against V.alginolyticus

3　討論

從世界水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治的發(fā)展趨勢(shì)來看，環(huán)境友好型的養(yǎng)殖方式和以免疫制劑為主的免疫防病是今后病害防控的主流方向，但是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖尚處于發(fā)展階段，藥物防治仍然是控制水生動(dòng)物疾病的主要手段。從1945年磺胺藥成功應(yīng)用于治療鱒魚癤瘡病，已有近40種抗菌藥物相繼應(yīng)用于水產(chǎn)，目前抗生素依然是防治細(xì)菌性病害的首選［9］。恩諾沙星和諾氟沙星是第三代喹諾酮類藥物，由于它們對(duì)海水養(yǎng)殖常見病原菌如殺鮭氣單胞菌、殺鮭弧菌和魯氏耶爾森菌等具有良好的抗菌活性，被廣泛應(yīng)用于海水養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的防治［10］。氟苯尼考是一種化學(xué)合成的氯霉素類新型獸用廣譜抗菌藥物，具有抗菌譜廣、吸收良好、體內(nèi)分布廣、無潛在致再生障礙性貧血的副作用和使用安全等特點(diǎn)。同時(shí)還填補(bǔ)了由于氯霉素禁用而產(chǎn)生的空白，目前已被廣泛應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中［11］。在浙江海水養(yǎng)殖漁用抗生素類藥物市場(chǎng)上，恩諾沙星等喹諾酮類藥物和氟苯尼考是兩類銷售比率最高的漁藥。但由于缺乏有效的監(jiān)管機(jī)制，目前水產(chǎn)漁藥市場(chǎng)還存在很多問題，本研究結(jié)果就發(fā)現(xiàn)了漁藥有效成分含量與藥物包裝所示含量不一致的情況，含量最低的只有包裝所示的25%。漁藥中有效成分含量是直接影響臨床用藥效果的因素之一，因?yàn)楫?dāng)漁藥有效含量低于包裝所示含量，會(huì)使推薦濃度下的漁藥無法達(dá)到疾病防治的效果。有研究認(rèn)為藥物劑量是影響藥物效應(yīng)的重要因素。同一種藥物，不同的劑量用于同一個(gè)體可能會(huì)產(chǎn)生不同的作用。低劑量投藥不僅在血液中達(dá)不到有效殺（抑）菌濃度，反而造成病原體產(chǎn)生耐藥性而使藥物失去作用，喹諾酮類藥物就是這類濃度依賴性藥物［12-13］。本研究調(diào)查同時(shí)還發(fā)現(xiàn)同樣成分的漁藥有多個(gè)產(chǎn)品名，如諾氟沙星又有新白濁克星、漁泰康和蟹病康等商品名。而在海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中，當(dāng)最初使用的藥物沒有達(dá)到預(yù)期效果時(shí)，不少養(yǎng)殖戶往往會(huì)通過更換藥物來控制疾病，這樣的“一藥多名”就很容易造成重復(fù)用藥、過量用藥。

最小抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC）是藥物抗菌活性的指標(biāo)，兩值的大小代表藥物抑殺病原微生物的能力的大小，數(shù)值越小則表明抗菌活性越強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)有些藥物的MBC值與其MIC值之間非常接近，如氨基糖苷類藥物。有些藥物的MBC值比MIC值大，如β內(nèi)酰胺類藥物［14］。目前臨床醫(yī)學(xué)上用MIC值來反應(yīng)細(xì)菌的耐藥性，如果受試藥物對(duì)供試微生物的MBC≥32倍的MIC，可判定微生物對(duì)受試藥物產(chǎn)生了耐藥性。本文中共測(cè)定了13種抗菌漁藥對(duì)常見海洋致病菌溶藻弧菌的MIC和MBC值，結(jié)果，所獲的MBC/MIC值均為1。其中藥物的MIC值介于0.022～18.94 mg/L之間，說明所測(cè)的喹諾酮類和氟苯尼考類藥物對(duì)該株溶藻弧菌具有優(yōu)良的抗菌效果。

本研究中獲得的不用廠家生產(chǎn)的同類藥物產(chǎn)品的MIC和MBC值存在一定差異，究其原因可能有：一是喹諾酮類漁藥本身的主要成分存在差異，導(dǎo)致同種藥物MIC和MBC值有變化。例如新白濁克星除了含有諾氟沙星成份外還有鹽酸小檗堿，而鹽酸小檗堿的抗菌譜廣，對(duì)多種革蘭陽性及陰性菌均具抑菌作用；二是藥物的水溶性差異，如氟苯尼考與同類抗生素相比水溶性較差［15］。本文中在對(duì)市售的氟苯尼考不同廠家的5種抗菌藥物進(jìn)行體外最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定時(shí)，直接將粉劑溶于水中來測(cè)定MIC和MBC值，獲得的5種氟苯尼考類漁藥對(duì)溶藻弧菌的MIC和MBC值之間存在較大差異，在0.022～4.48 mg/mL之間。溶液型氟苯尼考的MIC和MBC值最低，試驗(yàn)結(jié)果說明氟苯尼考在水中的溶解度影響了它的溶出速度，使得所測(cè)氟苯尼考藥物之間的MIC和MBC值出現(xiàn)了差異。氟苯尼考是新一代氯霉素類合成抗生素，它的活性作用和臨床應(yīng)用均優(yōu)于氯霉素，因此加強(qiáng)氟苯尼考的水溶性研究有利于推動(dòng)其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用［16-17］。目前提高氟苯尼考溶解度的固體制劑研究國(guó)內(nèi)已有報(bào)道，鄧?yán)蟮龋?8］通過將氟苯尼考與2-羥丙基-β-糊精包合，使氟苯尼考的溶解度增加了35.6倍；洪濤等［19］按不同比例用溶劑法將氟苯尼考與載體PVPK制成了固體分散體，使氟苯尼考溶解度提高為原藥的13.0倍。

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Determination of Effective Contents and in Vitro Antibacterial Activities of Thirteen Antibiotics in Mariculture

ZHAO Li1，2，SHI Hui1，LI Pei-pei1，et al
（1.Marine and Fisheries Research Institute of Zhejiang Province，Marine and Fishery Research Institute of Zhejiang Ocean University，Key Laboratory of Marine Culture and Enhancement of Zhejiang Province，Zhoushan316021；2.Fishery School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022，China）

In this study effective drug contents of eight quinolones and five florfenicols in mariculture were determined by high-performance liquid chromatography coupled with fluorescence（HPLC）and ultraperformance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry（ΜPLC-ESI-MS/MS）.The results showed that many antibiotics of commonly used the actual effective drug contents do not match the packaging. Only four kinds of quinolones effective drug contents are consistent with the packaging marked，the lowest effective content is only fifty-nine point two percent of marked.Three kinds of florfenicol effective contents are consistent with the packaging marked，the other two kinds of florfenicol effective drug contents are onlytwenty-five percent of marked.Minimal inhibitory concentrations（MIC）and minimal bactericidal concentrations （MBC）of thirteen drugs such as florfenicol and so on against marine pathogenic Vibrio alginolyticus were determined by tube dilution method.The results demonstrated that the antibacterial activities of florfenicol against Vibrio alginolyticus are similar to those of quinolone.MIC and MBC values against Vibrio alginolyticus are in the range 2.28-18.94 mg/L for quinolone，0.022-4.48 mg/L for florfenicol.

quinolone；florfenicol；HPLC；ΜPLC-ESI-MS/MS；MIC；MBC

S948

A

1008-830X（2015）02-0167-07

2014-12-10

浙江省科技廳項(xiàng)目（2012F30022；2015F30003；2015F10001；2015F50004）

趙莉（1987-），女，浙江嘉興人，碩士，研究方向：海水養(yǎng)殖病害.Tel:18505731015；E-mail:823226934@qq.com

施慧.E-mail:huishi2002@126.com