實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（RT—PCR）法與細(xì)胞培養(yǎng)法檢測流行性感冒病毒的比較

姜紅濤 姚秀林

[摘要] 目的 比較實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法與細(xì)胞培養(yǎng)法檢測流行性感冒病毒的差異。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及經(jīng)典的狗腎傳代細(xì)胞病毒分離2種方法，同時(shí)對流感監(jiān)測點(diǎn)送檢的80份疑似流感標(biāo)本檢測流感病毒。 結(jié)果 細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離的陽性數(shù)為26份，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的陽性數(shù)為36份，χ2=8.1， P<0.005。 結(jié)論 通過該實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的確快速敏感，適用于實(shí)驗(yàn)室快速診斷。

[關(guān)鍵詞] 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；細(xì)胞培養(yǎng)法；流感病毒

[中圖分類號(hào)] R4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2015）03（b）-0192-02

2013年出現(xiàn)的流感病毒H7N9經(jīng)自然重配，致病迅速，易變異，給人們帶來極度恐慌，引起WHO 的高度重視[1]，從而使流感病毒病原學(xué)的準(zhǔn)確快速診斷顯得尤為重要。該實(shí)驗(yàn)室在2014年1月采用整群抽樣法對撫順市流感監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院的80份疑似流感樣標(biāo)本進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法與細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行了檢測流行性感冒病毒的方法比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年1月在撫順市國家級(jí)流感監(jiān)測哨點(diǎn)醫(yī)院，每周采集內(nèi)科和兒科門診就診的流感樣病例（體溫≥38℃，同時(shí)伴有咳嗽或者咽喉疼痛等癥狀的急性呼吸道感染者）的咽拭子標(biāo)本，放人pH 7.4-7.6的DMEM采樣液中，當(dāng)日低溫送流感實(shí)驗(yàn)室檢測，每周采集 20份流感樣病例的咽拭子標(biāo)本。

1.2 主要試劑

①抗A（H1N1）亞型血清，抗A（H3N2）亞型血清，抗A（H3N2）亞型血清，抗A（SWL1）亞型血清，抗B型Yamagata系病毒血清，抗B型Victoria系病毒血清由國家流感中心提供。MDCK細(xì)胞，遼寧省疾控中心提供；胰酶、Hank液、胎牛血清﹑牛血清白蛋白組分V， 采購于BI公司。DMEM培養(yǎng)基，采購于GIBCO公司。

②提取RNA試劑盒為QIAGEN。

1.3 主要儀器

AB PCR儀；二氧化碳培養(yǎng)箱 ；倒置顯微鏡等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 采用細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒，細(xì)胞為狗腎傳代細(xì)胞（MDCK） 每份標(biāo)本接種細(xì)胞瓶2瓶，置34.5℃吸附1 h，倒掉感染液，再用Hanks液洗2遍，加入病毒維持液，置34.5 ℃培養(yǎng)，每天觀察病理變化（CPU），當(dāng)CPU出現(xiàn)3～4個(gè)加號(hào)時(shí)，按常規(guī)法檢查維持液中的紅細(xì)胞凝集活性。將HA≥1：16的標(biāo)本采用血凝抑制方法（HI）進(jìn)行流感病毒型別鑒定[2]。確定病毒的型別和亞型。并送國家流感中心做進(jìn)一步鑒定。HA≤1：16的標(biāo)本未做分型鑒定。

1.4.2 RT-PCR反應(yīng)體系的配置[3-4] 反應(yīng)條件：60℃ 5min→ 50℃ 30min→ 95℃ 15min→95℃ 15s，55℃退火30 s（收集熒光），72℃延伸 30s 45 cycle→ 72℃ 5min→4℃ 保存。見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

配對設(shè)計(jì)的χ2檢驗(yàn)，公式：χ2=（|b-c|-1）2/b+c v=1，P<0.005差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法對80份咽拭液檢測流行性感冒病毒的結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒26株，陽性百分率32.50%，RT-PCR檢出36株，陽性百分率45.00%，見表2。

2.2 兩種檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較

細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒36株，陽性26株，RT-PCR檢出36株，兩種檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果為χ2=8.1，因?yàn)棣?0.005，1=7.88，所以P<0.005，兩種檢驗(yàn)方法敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.3 兩種方法對80份咽拭液檢測流行性感冒病毒的分型結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒H1N1（22份），H3N2（4份），熒光定量RT-PCR分離病毒H1N1（31份），H3N2（4份），By（1份）。

3 討論

流感病毒病原學(xué)相關(guān)檢測目前常用的有病毒分離培養(yǎng)法、快速檢測、分子生物學(xué)方法等。病毒分離是診斷流感病毒的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，但耗時(shí)長是其缺點(diǎn)。而且宿主細(xì)胞生長狀態(tài)也是影響病毒生長及復(fù)制的關(guān)鍵因素[6]，導(dǎo)致疑似流感樣標(biāo)本到實(shí)驗(yàn)室后，培養(yǎng)完成時(shí)間不確定。同時(shí)培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)的持續(xù)消耗以及宿主細(xì)胞的逐漸死亡是導(dǎo)致病毒滴度降低的直接原因[7]，收獲的病毒滴度高低存在著很多的不確定因素。而且，標(biāo)本采集后的保存運(yùn)送等環(huán)節(jié)都對MDCK培養(yǎng)分離流感病毒存在較大的影響。而實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法應(yīng)用于流感病毒實(shí)驗(yàn)室診斷，國內(nèi)外早已有許多報(bào)導(dǎo)[8]，它具有靈敏度高、特異性好、檢測所需時(shí)間短等等優(yōu)點(diǎn)，尤其在應(yīng)急疫情快速診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。它與經(jīng)典的MDCK細(xì)胞分離法相比，檢測時(shí)間可縮短到1 d之內(nèi)。由于在封閉管中進(jìn)行，省略了電泳這一步驟，減少了以往PCR技術(shù)導(dǎo)致的假陽性可能[8]。

該實(shí)驗(yàn)室對2014年1月流感監(jiān)測點(diǎn)送檢的80份標(biāo)本，采用細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 兩種方法檢測，同時(shí)進(jìn)行比較， 結(jié)果證實(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法對流行性感冒病毒的檢出率為45.00%，高于細(xì)胞培養(yǎng)法的病毒檢出率32.50%。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法和細(xì)胞培養(yǎng)法兩種檢驗(yàn)方法χ2檢驗(yàn)結(jié)果為χ2=8.1，P<0.005。對流感病毒的檢出敏感性差異顯著，對流感病毒的分型也是準(zhǔn)確無誤，在病毒含量較低的標(biāo)本中不存在漏檢情況發(fā)生。通過這兩種方法的比較，與浙江省疾病預(yù)防控制中心通過比較得出的，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法對大量疑似標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速鑒別診斷，實(shí)用性強(qiáng)，快速敏感[9]的結(jié)論一致。驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法確實(shí)是實(shí)驗(yàn)室快速診斷流行性感冒病毒的首選方法，用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測為流感病毒陽性的標(biāo)本接種MDCK細(xì)胞，培養(yǎng)分離流感病毒，可以降低細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒的成本，減少不必要的試劑材料的消耗，提高檢測效率。這僅僅是本實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證結(jié)論，還需要其它研究中心加以驗(yàn)證。

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（收稿日期：2014-12-16）