R NA干擾技術在肝星狀細胞活化信號通路的應用

燕 晟 陽學風

南華大學附屬南華醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南衡陽 421001

R NA干擾技術在肝星狀細胞活化信號通路的應用

燕 晟 陽學風

南華大學附屬南華醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南衡陽 421001

肝纖維化是各種致病因子致肝細胞損傷后的修復過度。肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活被認為是肝纖維化的核心環(huán)節(jié)，實驗證實多條信號傳導通路參與HSC的激活。RNA干擾 (RNA interference，RNAi)能有效沉默目的基因，以HSC活化信號通路為切入點，設計小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制相關信號通路的活化，從而達到抑制HSC，激活是目前研究肝纖維化機制的主要手段。該研究綜述了RNAi技術在研究HSC活化信號途徑中的作用，以求為治療肝纖維化提供一種新思路。

肝纖維化；肝星狀細胞；信號通路；RNA干擾技術

肝纖維化是各種致病因子致肝細胞損傷后的修復過度，表現(xiàn)為肝結(jié)締組織異常增生，可進一步發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌，降低生活質(zhì)量，出現(xiàn)并發(fā)癥，嚴重危及生命。HSC是形成肝纖維化的主要細胞，它的激活被認為是肝纖維化的核心環(huán)節(jié)。多種信號傳導通路與該激活過程的調(diào)控有關。RNA干擾技術（RNA interference，RNAi）能特異性沉默目的基因，針對HSC活化信號途徑中的分子設計RNAi，能逆轉(zhuǎn)肝纖維化。該研究著重闡述了肝星狀細胞活化主要信號通路以及RNAi在這些信號通路的應用。

1 RNA干擾技術

RNAi是通過沉默目標基因以研究基因和蛋白質(zhì)功能的研究手段，被廣泛的用于臨床疾病研究。作用的起始階段正義鏈和反義鏈混合的雙鏈(double-stranded RNA,dsRNA)在細胞內(nèi)與核酸內(nèi)切酶Ⅲ結(jié)合后，其被切割成siRNA。效應階段siRNA則降解成正義鏈和反義鏈，后者與內(nèi)切核酸酶以及其他蛋白一起形成RNA誘導的沉默復合物 (RNA-induced silengcing complex,RISC)。RISC的核酸部分與外源性基因所表達mRNA靶向結(jié)合后，在結(jié)合部位切割mRNA，隨即RISC的蛋白部分引起mRNA降解。進入擴增階段，siRNA與mRNA結(jié)合，并將結(jié)合體作為引物，從而再次形成dsRNA。靶向mRNA全部降解致使目的基因沉默。

2 RNAi對致肝星狀細胞活化主要信號通路的應用

靜止狀態(tài)的HSC，細胞質(zhì)內(nèi)α-平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin-α,α-SMA)較少。當肝臟受損時，HSC增殖活躍，細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)分泌增多，胞質(zhì)內(nèi)α-SMA產(chǎn)生增多[1]，此即HSC活化。實驗證明轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路、Wnt信號通路、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)信號通路等均參與HSC的活化，進而參與肝纖維化的形成。而應用RNAi沉默信號通路中的各種信號分子，抑制HSC的活化，從而為治療肝纖維化提供新的途徑。

2.1 TGF-β/Smads信號通路

TGF-β是超家族TGF中的一員，其除了在ECM形成方面起著重要作用外還影響細胞的增殖、分化。不少學者發(fā)現(xiàn)參與肝臟損傷修復的細胞如肝細胞，枯否細胞，內(nèi)皮細胞分泌大量TGFβ1，TGFβ1 通過其受體（主要為 TβRⅠ及 TβRⅡ）作用于HSC，分泌大量 ECM，其中TGFβ1被認為是致肝纖維化最強的細胞因子。TGFβ1先與 TβRⅡ結(jié)合，再與活化的 TβRⅡ激酶結(jié)合使TβRⅠ磷酸化， 然后激活 Smad2、3，Smad2、3與 Smad4結(jié)合形成異源寡聚體，最后轉(zhuǎn)入胞核中發(fā)揮調(diào)控作用[2]。

有人用Smad3 siRNA轉(zhuǎn)染活化的HSC后膠原Ⅰ，Ⅲ，ⅠⅤmRNA表達受到了明顯抑制，說明阻斷TGF-β/Smad3信號傳導途徑能對抗纖維化進展。鄭素軍[3]等將Smad3-shRNA慢病毒感染HSC-T6 3后觀察細胞增殖，Smad3-shRNA組較對照組細胞增殖明顯下降 (P=0．00)，表明Smad3-shRNA可阻斷 TGFβ1對HSC－T6細胞的促增殖作用。而其他學者利用siRNA靶向沉默TGF-β1后，HSC激活相關指標均受到不同程度抑制，延緩肝纖維化進程，并一定程度上逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

2.2 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt/β-catenin信號通路即經(jīng)典β-catenin依賴信號通路，該通路被證實與某些癌癥、纖維化疾病、炎癥性腸病有關。βcatenin是該信號通路的核心部分，因為其游離態(tài)水平受腫瘤抑制因子結(jié)腸息肉基因產(chǎn)物、支架蛋白Axin、糖原合成酶激酶-3β構成的β-catenin降解復合體控制，在未活化細胞的細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)幾乎檢測不到[4]，當wnt蛋白與Frizzled受體結(jié)合后經(jīng)一系列反應最終導致β-catenin在細胞質(zhì)積累，當積累到一定水平可發(fā)生核轉(zhuǎn)移，故β-catenin在細胞核內(nèi)聚集，可作為該信號通路激活的標志。

有研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在活化HSC內(nèi)的表達水平較靜息狀態(tài)提高了5～7倍[5]，目前越來越多的研究結(jié)果證實經(jīng)典Wnt信號通路通過激活HSC參與了肝纖維化的形成。葛文松等[6-7]將siRNA β-Catenin轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞后，發(fā)現(xiàn)HSCs增殖明顯被抑制，最大抑制率達到44.8±2.8%(P<0.01)；HSC細胞凋亡增加達28.6%(P<0.05)，同時下調(diào)了Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNAs的表達。有研究證實Wnt/β-catenin信號通路通過下調(diào)PPARγ的表達而促進HSCs向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化[8]。Tsai等[9]利用 siRNA β-Catenin轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞，發(fā)現(xiàn)PPARγ表達上調(diào)，從而影響HSC的活化。

2.3 CTGF/整合素/FAK

CTGF（又稱CCN2）為一種富含半胱氨酸的分泌性多肽，具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等作用，還影響著細胞遷移、黏附等功能，并影響ECM的生成。CTGF在正常肝臟組織的CTGF表達很低，然而在肝纖維化患者體內(nèi)其表達顯著提高。整合素是跨膜蛋白家族成員之一，由α和β兩個亞基構成，亞基上的胞外區(qū)與ECM相連，同時還是CTGF的細胞表面受體。Huang等[10]證實CTGF能與HSC表面整合素α5β1受體結(jié)合，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖、黏附的功能。粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是體內(nèi)非受體型酪氨酸蛋白激酶之一，與相應配體結(jié)合后經(jīng)不同的信號轉(zhuǎn)導通路，調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、周期調(diào)控及凋亡等過程。FAK的N端與整合素亞基上的胞質(zhì)區(qū)結(jié)合后能傳遞細胞外來的信號。已有研究證實HSC活化伴隨著CTGF/整合素α5β1/FAK信號通路的活化并以此通路促進肝纖維化。郝春秋等[11]發(fā)現(xiàn)沉默CTGF后HCT-T6細胞的Ⅰ型膠原蛋白mRNA和蛋白的表達分別下調(diào)了74.21%和70.79%，同時ECM的產(chǎn)生受到抑制[12]。An等[13]利用RNA干擾技術沉默F(xiàn)AK基因能抑制HSC的增殖，并通過caspase-3和Bcl-2/Bax通路誘導HCS的凋亡。

2.4 Notch信號通路

Notch信號通路包括Notch受體、轉(zhuǎn)錄因子、DSL配體和靶基因這 4個核心組件，其中 Notch受體包括 Notch1、2、3、4，轉(zhuǎn)錄因子分別有 CBF-1、Suppressor of hairless和 Lag1， 而 Jagged1，Jagged2，Delta-like1，Delta-like3，Delta-like4 構 成 DSL 配 體 ，HES、Hey為靶基因。該信號通路通過Notch受體與配體結(jié)合，釋放出 NICD（Notch intracellular domain，NICD），其核定位序列能被轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)與CSL家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合使靶基因表達，從而調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡。陳毅雄[14]驗證了Notch受體1-3、DSL配體Jagged1以及靶基因HES1在HSC-T6中均有表達，在用Notch3-siRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞后α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白的表達下降，而用Jagged1-siRNA轉(zhuǎn)染后也有類似的作用，表明沉默Jagged1能有效抑制HSC的活化和ECM的產(chǎn)生。同時，研究還發(fā)現(xiàn)Notch3在正常肝組織中檢測不到，而在慢性活動性肝炎患者肝纖維化組織中的表達明顯上調(diào)，且α-SMA和Ⅰ型膠原表達增加；而沉默Notch3組中未發(fā)現(xiàn)上述表現(xiàn)[15]。

3 應用前景

近年來國內(nèi)外許多研究探討了肝纖維化的可能機制，其中HSC的激活在肝纖維化中的作用得到廣泛證實。而利用RNAi抑制HSC的活化能有效減緩肝纖維化進程。研究還發(fā)現(xiàn)信號傳導途徑之間有交互作用，共沉默不同通路的信號分子有擴大抗纖維化的作用，但目前此類研究尚少且多集中在動物實驗。肝纖維化發(fā)展成肝硬化后將不可逆轉(zhuǎn)，若在肝硬化之前逆轉(zhuǎn)肝纖維化將極大程度地減輕患者痛苦。

[1]劉永剛,陳厚昌,蔣毅萍.細胞因子與肝纖維化[J].醫(yī)學綜述,2001,7(10):620-622.

[2]Hill CS.Identification of a Smad phosphatase[J].ACS Chem Biol,2006,1(6):346-8.

[3]鄭素軍,邢欣悅,武聚山,等.Smad3 shRNA抑制TGFβ1對HSC-T6細胞活化的抗肝纖維化作用[J].臨床肝膽病雜志,2012,28(4):289-295.

[4]Kennell J,Cadigan KM.APC and beta-catenin degradation[J].Adv Exp Med Biol,2009,656:1-12.

[5]Douglas IS,Diaz dVF,Winn RA,et al.Beta-catenin in the fibroproliferative response to acute lung injury[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2006,34(3):274-85.

[6]Ge WS,Wang YJ,Wu JX,et al.β-catenin is overexpressed in hepatic fibrosis and blockage of Wnt/beta-catenin signaling inhibits hepatic stellate cell activation[J].Mol Med Rep,2014,9(6):2145-51.

[7]葛文松,吳建新,陳穎偉,等.siRNA沉默β-Catenin對肝星狀細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響[J].肝臟,2011,16(4):308-311.

[8]Yang MD,Chiang YM,Higashiyama R,et al.Rosmarinic acid and baicalin epigenetically derepress peroxisomal proliferator-activated receptor gamma in hepatic stellate cells for their antifibrotic effect[J].Hepatology,2012,55(4):1271-81.

[9]Tsai TH,Shih SC,Ho TC,et al.Pigment epithelium-derived factor 34-mer peptide prevents liver fibrosis and hepatic stellate cell activation through down-regulation of the PDGF receptor[J].PLoS One,2014,9(4):e95443.

[10]Huang G,Brigstock DR.Integrin expression and function in the response of primary culture hepatic stellate cells to connective tissue growth factor(CCN2)[J].J Cell Mol Med,2011,15(5):1087-95.

[11]郝春秋,彭梅娟,謝玉梅,等.腺病毒載體RNA干擾抑制結(jié)締組織生長因子表達及其抗纖維化作用[J].肝臟,2012,17(12):854-857.

[12]Hao C,Xie Y,Peng M,et al.Inhibition of connective tissue growth factor suppresses hepatic stellate cell activation in vitro and prevents liver fibrosis in vivo[J].Clin Exp Med,2014,14(2):141-50.

[13]An J,Zheng L,Xie S,et al.Down-regulation of focal adhesion kinase by short hairpin RNA increased apoptosis of rat hepatic stellate cells[J].APMIS,2011,119(6):319-29.

[14]陳毅雄.干預Notch信號通路治療大鼠肝纖維化[D].武漢:華中科技大學,2012.

[15]Chen YX,Weng ZH,Zhang SL.Notch3 regulates the activation of hepatic stellate cells[J].World J Gastroenterol,2012,18(12):1397-403.

The Application of RNA Interference Technique in the Signaling Pathways Involving HSCs Activation

YAN Sheng YANG Xuefeng
Affiliated Nanhua Hospital of University of South China，Hengyang ，Hunan Province，421001，China

Hepatic fibrosis is a over-healing response to multiple injuries.Activating hepatic stellate cells is considered to be the central event in liver fibrosis.Several signaling pathways involve HSCs activation.RNA interference technology is a efficient tool being applied in silencing targeted gene expression.Based on the molecular targets of the signaling pathways involving HSCs activation,individual siRNAs are be chosen to block the pathway.We review the effect of RNAi on the signaling pathways involving HSCs activation to come up with an idea treating hepatic fibrosis

Hepatic fibrosis;Hepatic stellate cells;The signaling pathways;RNA interference

R363

A

1674-0742（2015）01（a）－0074-02

國家自然科學基金項目資助（81373465）。

燕晟（1987-），女，湖北荊州人，碩士研究生，研究方向：肝病纖維化防治。

陽學風（1960.5-），男，湖南衡陽人，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：肝病纖維化防治，E-mail：yxf9988@126.com。

2014-10-16）