一種新的富集并計(jì)數(shù)肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液中惡性腫瘤細(xì)胞的方法

馬春華，姜镕，李金鐸，王斌，孫立偉，呂遠(yuǎn)

新技術(shù)交流

一種新的富集并計(jì)數(shù)肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液中惡性腫瘤細(xì)胞的方法

馬春華，姜镕△，李金鐸，王斌，孫立偉，呂遠(yuǎn)

目的 通過觀察腫瘤標(biāo)志物免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交技術(shù)平臺(tái)（TM-iFISH）富集并計(jì)數(shù)肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液中的惡性腫瘤細(xì)胞，探討一種新的檢測腦脊液中惡性腫瘤細(xì)胞的方法。方法 選取6例經(jīng)腦脊液細(xì)胞學(xué)或頭增強(qiáng)MRI掃描確診的肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者，每例患者經(jīng)腰椎穿刺獲取腦脊液20 mL（共10份），其中7.5 mL應(yīng)用TM-iFISH技術(shù)富集并計(jì)數(shù)腦脊液中的惡性腫瘤細(xì)胞，10 mL行腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查，2.5 mL行腦脊液生物化學(xué)檢查。結(jié)果 10份腦脊液標(biāo)本均順利完成上述檢測，其中7份標(biāo)本通過TM-iFISH技術(shù)計(jì)數(shù)示腫瘤細(xì)胞數(shù)為3～1 823個(gè)/7.5 mL腦脊液，3份腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，9份腦脊液生物化學(xué)檢查結(jié)果蛋白量高于正常值。3例患者治療后應(yīng)用TM-iFISH技術(shù)再次計(jì)數(shù)腦脊液惡性腫瘤細(xì)胞，2例患者計(jì)數(shù)較治療前減少。結(jié)論 TM-iFISH技術(shù)可以富集并計(jì)數(shù)肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液中惡性腫瘤細(xì)胞，可能成為肺癌腦膜轉(zhuǎn)移的診斷和療效評(píng)價(jià)方法。

腦膜；癌，非小細(xì)胞肺；腫瘤循環(huán)細(xì)胞；腦膜轉(zhuǎn)移；非小細(xì)胞肺癌；腦脊液；腫瘤標(biāo)志物免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交

腦膜轉(zhuǎn)移癌（leptomeningeal metastasis，LM）是指原發(fā)病灶的癌細(xì)胞在腦膜和脊髓蛛網(wǎng)膜下隙彌漫性播散或呈局灶浸潤的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移癌，常繼發(fā)于白血病、淋巴瘤、肺癌和乳腺癌［1］。未經(jīng)治療的腦膜轉(zhuǎn)移癌患者中位生存期僅4～6周，經(jīng)綜合治療后，其中位生存期僅能達(dá)到3～5個(gè)月［2］?，F(xiàn)階段早期診斷腦膜轉(zhuǎn)移癌仍為醫(yī)學(xué)難題，主要依據(jù)典型中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查和頭部MRI增強(qiáng)掃描進(jìn)行診斷。然而，超過90%的腦膜轉(zhuǎn)移瘤患者沒有典型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀和體征；首次腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查的陰性率高達(dá)45%，第2次腦脊液檢查的陽性率達(dá)80%；頭部強(qiáng)化MRI的特異性幾乎能夠達(dá)到100%，但存在 65%的假陰性率和 10%的假陽性率［3］。因此，尋找一種更為靈敏的方法來檢測腦膜的潛在轉(zhuǎn)移是十分必要的。血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞（cir?culating tumor cells，CTCs）即脫落入血的實(shí)體腫瘤細(xì)胞，與腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥［4］、預(yù)后和復(fù)發(fā)［5-6］等有明顯關(guān)聯(lián)性。腫瘤標(biāo)志物免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交技術(shù)平臺(tái)（tumor marker immunostaining-FISH，TM-iFISH）通過富集和分析技術(shù)可有效鑒別生物體液樣本中各種非血源性腫瘤上皮細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，目前尚鮮見關(guān)于用TM-iFISH技術(shù)檢測腦脊液中CTCs的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中采用TM-iFISH技術(shù)檢測10份腦脊液中的CTCs，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年3—9月在我院治療的非小細(xì)胞肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者6例，均為女性，中位年齡57.5歲，原發(fā)腫瘤病理類型均為肺腺癌；4例EGFR基因突變、K-Ras基因未突變；1例EGFR和K-Ras基因均未突變；1例基因突變情況未知。主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)性頭痛（5例）、認(rèn)知障礙（3例）、視覺障礙（2例）、耳聾（2例）、馬尾綜合征（2例）。5例合并腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移。符合以下條件：（1）經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)明確診斷的非小細(xì)胞肺癌患者。（2）經(jīng)腦脊液細(xì)胞學(xué)或影像學(xué)明確診斷的肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者。（3）實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果無腰椎穿刺術(shù)禁忌。（4）經(jīng)脫水藥物治療后顱內(nèi)高壓癥狀可獲得控制。（5）患者能耐受腰椎穿刺取腦脊液。（6）排除合并腦膜其他病變，如腦膜瘤、室管膜瘤等。（7）簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 TM-iFISH檢測 腰椎穿刺采集患者腦脊液20 mL，其中7.5 mL儲(chǔ)存于TM-iFISH檢測專用試管內(nèi)，常溫保存，3 d內(nèi)應(yīng)用TM-iFISH技術(shù)檢測CTCs。（1）免疫磁珠陰性篩選法富集細(xì)胞：使用包被抗CD45抗體的免疫磁珠去除CD45陽性的白細(xì)胞，將7.5 mL腦脊液制備成100 μL細(xì)胞懸液。（2）細(xì)胞計(jì)數(shù)：固定100 μL細(xì)胞懸液滴片，分別采用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色（陽性表明捕獲到的細(xì)胞為有核細(xì)胞）、8號(hào)染色體著絲粒探針（CEP8）檢測細(xì)胞8號(hào)染色體數(shù)目、抗細(xì)胞角蛋白-18（CK18）抗體染色（陽性表明捕獲到的細(xì)胞為上皮來源）和CD45抗體染色（陰性表明捕獲到的細(xì)胞為非白細(xì)胞）進(jìn)行免疫熒光分析。OLYMPUS-BX53熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，重復(fù)計(jì)數(shù)5次取平均值作為最終值。10 mL腦脊液行腫瘤細(xì)胞學(xué)檢查，另2.5 mL行生物化學(xué)檢測。

1.2.2 CTCs判斷標(biāo)準(zhǔn) 熒光顯微鏡下藍(lán)色通道下觀察DA?PI染色，藍(lán)色熒光者表明為有核細(xì)胞；橙色通道下觀察CEP8 FISH信號(hào)，橙色亮點(diǎn)數(shù)目即為8號(hào)染色體數(shù)目，大多數(shù)CTCs 8號(hào)染色體呈多倍體，即CEP8陽性，血源性白細(xì)胞8號(hào)染色體呈二倍體，即CEP8陰性；綠色通道下觀察細(xì)胞是否表達(dá)CK-18，呈綠色熒光即為陽性；紅色通道下觀察細(xì)胞是否表達(dá)CD45，呈紅色熒光即為陽性。最后在多通道下再次確認(rèn)細(xì)胞為非血源性上皮細(xì)胞來源的腫瘤細(xì)胞，即呈DA?PI+、CD45-、CK18+或CK18-、CEP8+；而呈現(xiàn)DAPI+、CD45+、CK18-、CEP8-時(shí)，則表明細(xì)胞為血源性白細(xì)胞。

2 結(jié)果

本組6例患者共10份腦脊液標(biāo)本順利通過TM-iFISH技術(shù)平臺(tái)檢測，其中 7份腦脊液發(fā)現(xiàn)3～1823個(gè)/7.5 mL腫瘤細(xì)胞，見圖1；3例患者治療后應(yīng)用TM-iFISH技術(shù)再次富集并計(jì)數(shù)腦脊液中的腫瘤細(xì)胞，2例計(jì)數(shù)較治療前減少，1例治療前后均未能富集并計(jì)數(shù)到腫瘤細(xì)胞。3份腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查采用HE染色發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，但該方法不能對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。9份腦脊液生物化學(xué)檢查結(jié)果蛋白量高于正常值。全組患者治療前、后行頭部增強(qiáng)MRI檢查均顯示腦膜轉(zhuǎn)移征象，但無明顯變化。

Fig.1 Image of enriched cells under fluorescence microscope（×400）圖1 熒光顯微鏡下富集的細(xì)胞圖像（×400）

3 討論

腦膜轉(zhuǎn)移癌是指原發(fā)病灶中的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移并彌漫性浸潤軟腦膜、蛛網(wǎng)膜下腔引起腦組織、腦神經(jīng)和脊髓受損癥狀與體征。目前國內(nèi)診斷腦膜轉(zhuǎn)移癌主要采用以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）具有明確的腫瘤病史。（2）新發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀與體征。（3）典型的MRI表現(xiàn)。（4）腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞。凡具備前2項(xiàng)及第3或4項(xiàng)中的任一項(xiàng)即可確診。然而，腦膜轉(zhuǎn)移癌的臨床表現(xiàn)常因腫瘤細(xì)胞侵犯的部位不同而復(fù)雜多樣，缺乏特異性，與腦實(shí)質(zhì)、脊髓轉(zhuǎn)移引起的癥狀以及治療原發(fā)腫瘤出現(xiàn)的不良反應(yīng)很難鑒別［7］。在本研究中，6例患者的主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)性頭痛（5例）、認(rèn)知障礙（3例）、視覺障礙（2例）、耳聾（2例）、馬尾綜合征（2例），符合腦膜轉(zhuǎn)移癌的主要臨床表現(xiàn)。但5例患者合并有腦轉(zhuǎn)移，全組病例均進(jìn)行了鞘內(nèi)化療或靜脈化療。因此臨床上很難對(duì)上述癥狀進(jìn)行鑒別診斷。本研究中9份腦脊液的生物化學(xué)檢查提示蛋白含量升高，考慮與腫瘤細(xì)胞浸潤腦膜及其代謝產(chǎn)物的化學(xué)刺激，造成血腦屏障的破壞和血管通透性增加，導(dǎo)致蛋白滲出增加有關(guān)。腦脊液生物化學(xué)檢測結(jié)果提示腦脊液其檢測敏感度較高，但其缺乏特異性，僅能作為臨床參考的一項(xiàng)指標(biāo)。在本研究中，6例肺癌腦膜轉(zhuǎn)移癌患者既往均經(jīng)腦脊液細(xì)胞涂片或頭部強(qiáng)化MRI掃描檢查明確診斷為腦膜轉(zhuǎn)移癌，但在本研究中僅3份患者腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，提示腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查的隨機(jī)性較大，且不能計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞。增強(qiáng)MRI掃描的典型表現(xiàn)為腦膜增厚或伴有結(jié)節(jié)、腦膜線形或條索樣強(qiáng)化、腦膜彌漫性強(qiáng)化，有時(shí)可見“尾征”等直接征象，并伴有腦實(shí)質(zhì)容量變小、腦水腫、腦室周圍水腫等繼發(fā)性改變［8］。本組6例患者治療后復(fù)查頭部增強(qiáng)MRI掃描均發(fā)現(xiàn)腦膜轉(zhuǎn)移癌的典型征象，但均未提示腦膜轉(zhuǎn)移范圍存在明顯變化，因此增強(qiáng)MRI掃描很難對(duì)腦膜轉(zhuǎn)移癌進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。筆者認(rèn)為腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查及增強(qiáng)MRI掃描在診斷腦膜轉(zhuǎn)移癌、療效評(píng)價(jià)方面不能滿足臨床醫(yī)師的需要，因此，尋找更靈敏的檢測方式是十分必要的。

腫瘤標(biāo)志物免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交技術(shù)平臺(tái)即TM-iFISH，通過富集技術(shù)和分析技術(shù)在生物體液標(biāo)本中有效鑒別各種非血源性腫瘤上皮細(xì)胞，對(duì)鑒別CTCs具有較高的靈敏性和特異性。研究顯示該類技術(shù)檢測腦脊液中CTCs，進(jìn)而診斷乳腺癌［3］、惡性黑色素瘤［9］、肺癌腦膜轉(zhuǎn)移［10］具有較高的敏感度。本研究中6例患者共10份腦脊液標(biāo)本均經(jīng)TM-iFISH檢測富集并計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞，其中7份腦脊液標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)為3～1 823個(gè)/7.5 mL。3例患者治療后再次應(yīng)用TM-iFISH技術(shù)檢測腦脊液中的腫瘤細(xì)胞，2例患者腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)較治療前減少，1例患者治療前后均未能富集并計(jì)數(shù)到腫瘤細(xì)胞。腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的3份標(biāo)本，TM-iFISH檢測的腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)亦高于其余7份標(biāo)本，二者是否存在相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明TM-iFISH檢測技術(shù)對(duì)腦脊液中腫瘤細(xì)胞具有較高的敏感度，且可計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞數(shù)，在腦膜轉(zhuǎn)移癌的診斷和療效評(píng)價(jià)方面較腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查、增強(qiáng)MRI掃描表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)。

［1］Leal T，Chang JE，Mehta M，et al.Leptomeningeal metastasis:chal?lenges in diagnosis and treatment［J］.Curr Cancer Ther Rev，2011，7 （4）：319-327.

［2］Nagpal S，Riess J，Wakelee H.Treatment of leptomeningeal spread of NSCLC：a continuing challenge［J］.Curr Treat Options Oncol，2012，13（4）：491-504.

［3］Emilie Le Rhun，F(xiàn)rédéric Massin，Qian Tu，et al.Development of a new method for identification and quantification in cerebrospinal fluid of malignant cells from breast carcinoma leptomeningeal me?tastasis［J］.BMC Clinical Pathology，2012，12:21.

［4］Igawa S，Gohda K，F(xiàn)ukui T，et al.Circulating tumor cells as a prog?nostic factor in patients with small cell lung cancer［J］.Oncol Lett，2014，7（5）:1469-1473.

［5］Yu Y，Chen ZL，Dong JS，et al.Folate receptor-positive circulating tumor cells as a novel diagnostic biomarker in non-small cell lung cancer［J］.Transl Oncol，2013，6（6）:697-702.

［6］Romiti A，Raffa S，Di Rocco R，et al.Circulating tumor cells count predicts survival in colorectal cancer patients［J］.J Gastrointestin Liver Dis，2014，23（3）:279-284.

［7］Ma CH，Jiang R，Li JD，et al.Research progress of lung cancer with leptomeningeal metastasis［J］.Chinese Journal of Lung Cancer，2014，17（9）:695-700.［馬春華，姜镕，李金鐸，等.肺癌腦膜轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展［J］.中國肺癌雜志，2014，17（9）:695-700］.

［8］Clarke JL，Perez HR，Jacks LM，et al.Leptomeningeal metastases in the MRI era［J］.Neurology，2010，74（18）:1449-1454.

［9］Le Rhun E，Tu Q，De Carvalho Bittencourt M，et al.Detection and quantification of CSF malignant cells by the cell search technology in patients with melanoma leptomeningeal metastasis［J］.Med Oncol，2013，30（2）:538.

［10］Jiang R，Ma CH，Zhu ZL，et al.Application of detecting cerebrospi?nal fluid circulating tumor cells in the diagnosis of meningeal metas?tasis of non-small cell lung cancer［J］.Chin J Contemp Neurol Neuro?surg，2014，14（8）:704-707.［姜镕，馬春華，朱子龍，等.腦脊液循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測在非小細(xì)胞肺癌腦膜轉(zhuǎn)移診斷中的應(yīng)用［J］.中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2014，14（8）:704-707］.

（2014-10-28收稿 2014-11-27修回）

（本文編輯 閆娟）

A novel methodology to concentrate and quantify malignant cells in CSF from lung cancer patients with leptomeningeal metastasis

MA Chunhua，JIANG Rong△，LI Jinduo，WANG Bin，SUN Liwei，LYU Yuan
Department of Intervention，Tianjin HuanHu Hospital，Tianjin Key Laboratory of Cerebral Vascular and Neurodegenerative Disease，Tianjin 300060，China
△Corresponding Author E-mail：jiangrong1989@sina.com

Objective To assess the value of tumor marker immunostaining-FISH（TM-iFISH）technology on concen?trating and enumeration of tumor cells in CSF of lung cancer patients with leptomeningeal metastasis（LM）.Methods Six cases of non-small cell lung cancer with leptomeningeal metastasis，which were diagnosed by CSF cytology or enhanced MRI scan，were selected.A total of 20 mL of CSF was collected in each case.TM-iFISH technology was employed to concen?trate and quantify circulating tumor cells in 7.5 mL CSF samples in each case while CSF cytology used 10 mL CSF samples in each case；Finally，the rest 2.5 mL CSF in each case was used for biochemistry assay.Results Ten CSF samples from 6 patients with non-small lung cancer with LM were assayed and tumor cells numbers ranging between 3 and 1 823 every 7.5 mL were found in 7 samples.On the other hand，CSF cytology examination only revealed tumor cells in 3 cases.Using CSF biochemical assay，higher than normal of protein level was found in 9 cases.TM-iFISH technology was employed again in 3 cases of patients who received treatment.Tumor cell count in CSF reduced in 2 out of the 3 cases.Conclusion TM-iFISH technology is a new method for detection and enumeration of tumor cells in the CSF in non-small cell lung cancer patients with leptomeningeal metastasis.This technology present diagnosis and curative values in lung cancer patients with leptomen?ingeal metastasis.

meninges；carcinoma，non-small-cell lung；neoplasm circulating cells；leptomeningeal metastasis；nonsmall cell lung cancer；cerebrospinal fluid；tumor marker immunostaining-FISH

R742

B

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.023

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目（2014KZ042）

天津市環(huán)湖醫(yī)院腫瘤介入科，天津市腦血管與神經(jīng)變性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300060）

馬春華（1981），男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤介入化療研究

△E-mail:jiangrong1989@sina.com