• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    志賀菌1、2類(lèi)整合子及ISCR1攜帶情況與耐藥性的關(guān)系

    2015-08-24 08:41:57董利娟楊賢王俊祁偉呂星梁帆
    天津醫(yī)藥 2015年4期
    關(guān)鍵詞:耐藥性測(cè)序耐藥

    董利娟,楊賢,王俊,祁偉△,呂星,梁帆

    專題研究·細(xì)菌與耐藥

    志賀菌1、2類(lèi)整合子及ISCR1攜帶情況與耐藥性的關(guān)系

    董利娟1,楊賢1,王俊1,祁偉1△,呂星2,梁帆3

    目的 了解天津地區(qū)志賀菌1類(lèi)、2類(lèi)整合子及插入序列共同區(qū)(ISCR1)攜帶情況及其與耐藥性的關(guān)系。方法 K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定臨床分離的159株志賀菌的藥敏情況。以煮沸法制備細(xì)菌總DNA作為PCR擴(kuò)增模板。采用PCR方法擴(kuò)增1類(lèi)、2類(lèi)整合子及ISCR1并測(cè)序分析。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序,結(jié)果經(jīng)BLAST程序與Gen?Bank數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)株比對(duì)分析。結(jié)果 159株志賀菌中,53株福氏志賀菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率最高88.68%,其次是鏈霉素81.13%、氯霉素及SMZco均為56.60%,多重耐藥率77.36%;106株宋氏志賀菌對(duì)氨芐西林的耐藥率最高97.17%,其次是SMZco95.28%、四環(huán)素83.96%、慶大霉素76.42%,多重耐藥率98.11%。1類(lèi)整合子陽(yáng)性118株,其中典型1類(lèi)整合子23株,共有5種基因盒,分別為aadA2、aadA1、dfrⅠ、blaoxa-10及blaoxa-1;非典型1類(lèi)整合子95株,基因包括intI1、aadA、blaoxa-1和IS1等;2類(lèi)整合子陽(yáng)性89株,其基因盒有dfrA1、satl及aadA1;1類(lèi)、2類(lèi)整合子同時(shí)陽(yáng)性的菌株70株。未發(fā)現(xiàn)ISCR1陽(yáng)性菌株。整合子陽(yáng)性菌株中多重耐藥率高于整合子陰性菌株(90.65%vs 50%,P<0.05)。結(jié)論 1、2類(lèi)整合子廣泛存在于志賀菌中且與志賀菌的多重耐藥相關(guān)。

    志賀菌屬;整合子類(lèi);耐藥性,微生物;序列共同區(qū)

    細(xì)菌性痢疾居我國(guó)法定傳染病發(fā)病率的第3位,是我國(guó)最常見(jiàn)的感染性腹瀉之一[1]。隨著抗生素的廣泛使用,志賀菌耐藥率上升,并呈現(xiàn)多重耐藥趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),整合子及插入序列共同區(qū)(ISCR)作為一種可移動(dòng)元件,與細(xì)菌耐藥率上升及多重耐藥趨勢(shì)的出現(xiàn)密切相關(guān)[1]。本研究對(duì)分離出的志賀菌臨床株攜帶1類(lèi)、2類(lèi)整合子及ISCR1情況進(jìn)行調(diào)查并分析其與耐藥性的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 菌株及來(lái)源 收集分離自天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、天津市兒童醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院3所三級(jí)甲等醫(yī)院腸道門(mén)診就診患者的糞便標(biāo)本中志賀菌共計(jì)159株。經(jīng)常規(guī)生化及血清凝集試驗(yàn)證實(shí),其中包括福氏志賀菌53株,宋氏志賀菌106株。ISCR1陽(yáng)性菌株2414及質(zhì)控菌株ATCC25922為本研究所保存。

    1.2 培養(yǎng)基及藥敏紙片 水解酪蛋白(MH)瓊脂購(gòu)自上海伊華生物科技有限公司。藥敏紙片包括氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、亞胺培南、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、阿米卡星、氧氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明(SMZco)、頭孢哌酮、氯霉素共14種,購(gòu)自北京天壇生物制品研究所。引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

    1.3 方法

    1.3.1 抗菌藥物敏感試驗(yàn) 所有菌株嚴(yán)格按照2012年臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)的規(guī)定,采用改良Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法進(jìn)行檢測(cè),質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

    1.3.2 細(xì)菌總DNA的提取 采用煮沸法提取細(xì)菌總DNA[2]。

    1.3.3 志賀菌相關(guān)基因的檢測(cè)與測(cè)序分析 引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)體系、條件參照文獻(xiàn)[3-5]的方法進(jìn)行。7對(duì)引物分別擴(kuò)增1類(lèi)整合子整合酶、1類(lèi)整合子可變區(qū)、3'保守末端(3'CS)、非典型1類(lèi)整合子基因盒、2類(lèi)整合子整合酶、2類(lèi)整合子可變區(qū)及插入序列共同區(qū)ISCR1,見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色后,凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的標(biāo)準(zhǔn)菌序列進(jìn)行比對(duì)、分析,確定基因型。

    1.3.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 DNA擴(kuò)增熱循環(huán)(PCR)儀(德國(guó)Ep?pendorf公司)、DYY-6D型電泳儀(北京六一儀器廠)、GEL?DOC-200型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)及Quanti?ty One 4.6版分析軟件。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 藥敏試驗(yàn) 159株志賀菌藥敏結(jié)果顯示,福氏志賀菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率最高,其次是鏈霉素、氯霉素及SMZco;多重耐藥率77.36%。宋氏志賀菌對(duì)氨芐西林的耐藥率最高,其次是SMZco、四環(huán)素和慶大霉素;多重耐藥率98.11%。159株志賀菌的多重耐藥率為89.94%。未發(fā)現(xiàn)對(duì)亞胺培南耐藥的菌株。見(jiàn)表2。

    Tab.1 The PCR primer sequences表1 PCR反應(yīng)引物

    Tab.2 Antibiotic sensitivity of different serotype of 2009/2010 and 2013 years表2 2009、2010年及2013年組不同血清型藥敏結(jié)果

    2.2 整合子分布及與耐藥性的關(guān)系 159株志賀菌中,1類(lèi)整合子陽(yáng)性的菌株數(shù)為118株(74.21%),2類(lèi)整合子陽(yáng)性的菌株數(shù)為89株(55.97%),1類(lèi)、2類(lèi)整合子均陽(yáng)性的有70株。見(jiàn)表3。

    Tab.3 Distribution of integrase in different serotypes表3 不同血清型整合酶攜帶情況 例(%)

    2.2.1 1類(lèi)整合子的分布 118株1類(lèi)整合子陽(yáng)性的菌株中,典型1類(lèi)整合子23株,福氏志賀菌20株,宋氏志賀菌3株;非典型1類(lèi)整合子95株,福氏志賀菌23株,宋氏志賀菌72株。典型1類(lèi)整合子部分PCR擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖1。

    Fig.1 Electrophoresis of intI1/variable region/3'CS of typical class 1 integrons圖1 典型1類(lèi)整合子intI1、可變區(qū)、3'CS基因擴(kuò)增圖譜

    典型1類(lèi)整合子可變區(qū)共有5種基因盒:氨基糖苷腺苷?;D(zhuǎn)移酶A2(aadA2)、aadA1、二氫葉酸還原酶Ⅰ(dfrⅠ)、blaoxa-10及 blaoxa-1。20株福氏志賀菌中,18株攜帶aadA1、dfrⅠ及blaoxa-10的基因盒;另2株攜帶aadA2、dfrⅠ及blaoxa-1的基因盒。3株宋氏志賀菌中2株攜帶aadA2+blaoxa-10+dfrⅠ,另1株攜帶aadA1+blaoxa-1+dfrⅠ。

    對(duì)非典型1類(lèi)整合子測(cè)序分析,表明此插入片段依次由intI1基因、attI位點(diǎn)以及2個(gè)基因盒組成,3'保守區(qū)部分被一段插入序列IS1所替代;經(jīng)BLAST比較,兩個(gè)基因盒分別為blaoxa-1和aadA1。

    2.2.2 2類(lèi)整合子的分布 攜帶2類(lèi)整合子的89株,福氏志賀菌21株,宋氏志賀菌68株。帶有dfrA1、耐鏈絲菌素(satl)及aadA1 3種基因盒;部分菌株P(guān)CR擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖2。

    Fig.2 Electrophoresis of intI2/variable region of class 2 integrons圖2 2類(lèi)整合子intI2、可變區(qū)基因擴(kuò)增圖譜

    2.2.3 整合子與多重耐藥性的關(guān)系 intI1和(或)intI2陽(yáng)性菌株中多重耐藥所占比例為90.65%,高于整合子陰性菌株的50%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 23.34,P<0.05);其中intI1、intI2陽(yáng)性菌株中多重耐藥菌株出現(xiàn)的比率分別為91.53%和94.38%。

    2.3 插入序列共同區(qū)分布情況 對(duì)159株志賀菌進(jìn)行插入序列共同區(qū)(ISCR1)擴(kuò)增,未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增條帶。

    3 討論

    近年來(lái)由于抗生素的廣泛及不合理使用,細(xì)菌的耐藥問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重,細(xì)菌的多重耐藥現(xiàn)象隨之發(fā)生。研究表明,整合子作為可移動(dòng)基因元件,能整合不同的耐藥基因盒表達(dá)出對(duì)抗菌藥物的耐藥甚至多重耐藥。目前,具有捕獲及表達(dá)外來(lái)基因能力的整合子系統(tǒng)越來(lái)越引起研究者的關(guān)注,尤其對(duì)多重耐藥性研究有著非常重要的意義[6-7]。

    整合子的基本結(jié)構(gòu)由5'保守末端(5'CS)、3'保守末端(3'CS)及兩者之間的可變區(qū)構(gòu)成??勺儏^(qū)含有1個(gè)或多個(gè)基因盒。整合子含有1個(gè)編碼整合酶的基因(intI),1個(gè)重組位點(diǎn)attI和1個(gè)啟動(dòng)子3個(gè)功能元件。這3個(gè)功能元件均位于整合子5'CS區(qū)。3'CS區(qū)則因整合子類(lèi)型不同而異。在1類(lèi)整合子中把intI1陽(yáng)性、可變區(qū)陽(yáng)性及3'CS陽(yáng)性的稱之為典型1類(lèi)整合子,只有intI1陽(yáng)性的稱之為非典型1類(lèi)整合子。有學(xué)者利用反向PCR方法在非典型1類(lèi)整合子中擴(kuò)增出基因盒片段[3]。臨床中出現(xiàn)多重耐藥與整合子對(duì)耐藥基因的積累是分不開(kāi)的[8]。

    本研究顯示,我院近年臨床分離的志賀菌對(duì)四環(huán)素、鏈霉素、氨芐西林和SMZco的耐藥較為嚴(yán)重(均在50%以上);多重耐藥率89.94%。整合子檢出率高達(dá)86.16%(137/159)??勺儏^(qū)分別攜帶aadA2、blaoxa-10、dfrⅠ及satl等耐藥基因。在本實(shí)驗(yàn)中1類(lèi)、2類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株中多重耐藥株所占比例高于整合子陰性菌株,表明1、2類(lèi)整合子在志賀菌多重耐藥中起到重要作用,與文獻(xiàn)[9-10]的報(bào)道相似。部分1、2類(lèi)整合子陽(yáng)性的菌株未檢出可變區(qū),可能的原因有:(1)整合子基因突變,即3'CS缺失;(2)可變區(qū)長(zhǎng)度超過(guò)PCR的可擴(kuò)增范圍[11]。

    Stokes等[12]首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道在復(fù)合1類(lèi)整合子中發(fā)現(xiàn)了稱作ISCR的DNA序列,此序列和許多耐藥基因緊密連接。ISCR不同于以往的插入序列,它是一種新型的可移動(dòng)元件。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外多位學(xué)者在大腸埃希菌、克雷伯桿菌、枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌等多種革蘭陰性菌中發(fā)現(xiàn)了ISCR1的存在,且與細(xì)菌的耐藥性有一定的相關(guān)性,但本文在對(duì)分離的志賀菌屬的研究中未發(fā)現(xiàn)ISCR1陽(yáng)性菌株。

    [1]Chen YH,Lin HY.Study of the distribution and drug resistance of ClassⅠandⅡintegrons in Bacillus proteus[J].China J Nosocomi?ol,2014,24(3):526-528.[陳奕慧,林紅燕.Ⅰ、Ⅱ類(lèi)整合子在變形菌屬中的分布及耐藥性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2014,24 (3):526-528].doi:1005-4529(2014)03-0526-03.

    [2]Talukder KA,Islam MA,Dutta DK,et al.Phenotypic and genotypic characterization of serologically atypical strains of Shigella flexneri?type 4 isolated in Dhaka,Bangladesh[J].Clin Microbiol,2002,40 (4):2490-2497.doi:10.1128/JCM.40.7.2490-2497.2002.

    [3]Pan JC.Characteristic of Class 1 and Class 2 Integron and their Rela?tion to Antibiotic Resistance in Shigella isolates from Hangzhou,China[D].Zhejiang:Institute of Infectious Diseases,The first Affili?ated Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,2000.[潘勁草.志賀菌流行株1類(lèi)和2類(lèi)整合子的特征及與耐藥性關(guān)系的研究[D].浙江:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病研究所,2000].

    [4]Wang J,Qi W,Wang SX,et al.Study on integrons and antibiotic re?sistance of Shigella flexneri in Tianjin[J].Journal of Pathogen Biolo?gy,2014,9(2):146-149.[王俊,祁偉,王淑香,等.天津地區(qū)福氏志賀菌整合子攜帶及耐藥性研究[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2014,9 (2):146-149].doi:10.13350/j.cjpb.140213.

    [5]Wu XM,Song SD,Qi W.Relation between ISCR1 and ESBLs gene in third generation cephalosporin clinical strains of Enterobaceria?ceae[J].Chinese Journal of Infecrion Control,2011,10(2):86-92.[吳小妹,宋詩(shī)鐸,祁偉.腸桿菌科耐第三代頭孢菌素臨床株中ISCR1元件與ESBLs基因的關(guān)系[J].中國(guó)感染控制雜志,2011,10(2):86-92].doi:1671-9638(2011)02-0086-06.

    [6]Wu K,Wang F,Sun J,et al.Class 1 integron gene cassettes in multi?druh-resistant Gram-negative bacteria in southern China[J].Int J Antimicrob Agents,2012,40(3):264-267.doi:10.1016/j.ijantimi?cag.2012.05.017.

    [7]Shen Y,Qian H,Gong J,et al.High prevalence of Antibiotic Resis?tance and Molecular Characterization of Integrons among Shigella Isolates in Eastern China[J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(3):1549-1551.doi:10.1128/AAC.02102-12.

    [8]Li LM,Yuan XY,Wang MY,et al.The integron-gene cassette sys?tem and the echanism of bacterial drug resistance:research progress [J].Chinese Journal of Microecology,2014,26(2):246-248.[李魯明,袁曉燕,王明義,等.整合子-基因盒系統(tǒng)與細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生態(tài)學(xué)雜志,2014,26(2):246-248].doi:10.13381/j.cnki.cjm.201402033.

    [9]Tariq A,Haque A,Ali A,et al.Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad,Pakistan[J].Can J Mi?crobiol,2012,59(9):1047-1054.doi:10.1139/w2012-085.

    [10]Yang HF,Chen GS,Zhu YL,et al.Surbeillance of Antimicrobial Susceptibility Patterns among Shigella Species Isolated in China during the 7-year Period of 2005-2011[J].Ann Lab Med,2013,33 (2):111-115.doi:10.3343/alm.2013.33.2.111.

    [11]Jiang B,Wei QH,Lyu HX.Molecular characteristics of typeⅠinte?gron in Escherichia coli isolated from urine and correlation with drug resistance[J].China Journal Nosocomiol,2014,24(1):5-8.[姜波,魏取好,呂火祥.尿液分離大腸埃希菌Ⅰ類(lèi)整合子分子特征與耐藥性的關(guān)系研究[J].中國(guó)醫(yī)院感染學(xué)雜志,2014,24(1):5-8].doi: 10.11816/cn.ni.2014-132892.

    [12]Stokes HW,Tomaras C,Parsons Y,et al.The partial 3'-conserved segment duplications in the integrons In6 from pDGO100 have a common origin[J].Plasmid,1993,30(1):39-50.

    (2014-06-18收稿 2014-11-14修回)

    (本文編輯 魏杰)

    Carriage rates of class 1,class 2 integrons as well as ISCR1 in Shigella isolates and their relationship with drug resistance

    DONG Lijuan1,YANG Xian1,WANG Jun1,QI Wei1△,LYU Xing2,LIANG Fan3
    1 Second Hospital of Tianjin Medical University Institute of Infectious Disease,Tianjin 300211,China;2 Tianjin Medical University General Hospital;3 Tianjin Children's Hospital
    △Correspongding Author E-mail:qiweiwyx@yahoo.com

    Objective To explore carrying rates of class 1,class 2 integrons as well as ISCR1 in Shigella isolates and their connection with drug resistance.Methods Antibiotic sensitivities were detected by K-B disk diffusion in 159 clinical isolates.Total bacteria DNA was prepared through boiling the isolates and the DNA was then used as template for PCR amplification.PCR,ZSCR1 and sequencing analyse of integrons were applied to all of them.Results were compared by Blast and GenBank.Results Antibiotic sensitivity results showed that in the S.flexneri strains the incidence of resistance to tet?racycline and streptomycin were 88.68% and 81.13% in the S.flexneri strains while the incidence of resistant to chloram?phenicol and trimethoprim-sulfamethoxazol were both 56.60%,and the incidence of multidrug drug resistance was 77.36%.In the sonnei strains,the incidence of resistance to ampicillin,trimethoprim-sulfamethoxazo were 97.17% and 95.28%,83.96% and 76.42% respectively,and the incidence of multidrug resistance was 98.11%.Among all isolates,118 were class 1 integron positive,70 were class 2 integron positive and 89 were double positives.For those 118 isolates that are positive of class 1 integron,23 were typical while 95 weres atypical.The gene cassettes of typical class 1 integrons contains aadA2,aa?dA1,dfrⅠ,blaoxa-10 and blaoxa-1.IntI1,aadA,blaoxa-1 and IS1 were included in the gene cassetes of the atypical class 1 integrons.Class 2 integrons positive isolates carried gene cassttes which include dfrA1,satl and aadA1.No ISCR1 was found in any isolate.Integron carriage strains were closely associated with higher rate of multiple antibiobic resistance compared with the organisms without integrons(90.65%,50%,P<0.05).Conlusion Class 1 and class 2 integrons were widely existence in Shigella isolates and were related to the multidrug resistance.

    shigella;integrons;drug resistance,microbiol;sequence common region

    R378.25

    A

    10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.018

    1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染研究所(郵編300211);2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院;3天津市兒童醫(yī)院

    董麗娟(1989),女,碩士在讀,主要從事志賀菌耐藥性方面研究

    △E-mail:qiweiwyx@yahoo.com

    猜你喜歡
    耐藥性測(cè)序耐藥
    杰 Sir 帶你認(rèn)識(shí)宏基因二代測(cè)序(mNGS)
    新民周刊(2022年27期)2022-08-01 07:04:49
    如何判斷靶向治療耐藥
    miR-181a在卵巢癌細(xì)胞中對(duì)順鉑的耐藥作用
    長(zhǎng)絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析
    二代測(cè)序協(xié)助診斷AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌腦膜炎1例
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:58
    嬰幼兒感染中的耐藥菌分布及耐藥性分析
    WHO:HIV耐藥性危機(jī)升級(jí),普及耐藥性檢測(cè)意義重大
    PDCA循環(huán)法在多重耐藥菌感染監(jiān)控中的應(yīng)用
    基因捕獲測(cè)序診斷血癌
    單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展
    成人国产一区最新在线观看| 黄色视频不卡| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产av不卡久久| 特大巨黑吊av在线直播 | 视频在线观看一区二区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 国产人伦9x9x在线观看| 两个人视频免费观看高清| 色在线成人网| 国产午夜福利久久久久久| 精品高清国产在线一区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黄频高清免费视频| 亚洲av美国av| 国产1区2区3区精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产单亲对白刺激| 午夜免费激情av| 99热只有精品国产| 日本免费一区二区三区高清不卡| 午夜日韩欧美国产| 欧美国产日韩亚洲一区| 男人操女人黄网站| 黄频高清免费视频| 亚洲,欧美精品.| 午夜福利在线在线| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 热re99久久国产66热| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久九九热精品免费| 嫩草影院精品99| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产区一区二久久| 亚洲国产精品成人综合色| 国产一区二区在线av高清观看| 国产又爽黄色视频| 男人舔女人的私密视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 免费在线观看亚洲国产| 悠悠久久av| 亚洲最大成人中文| 国产亚洲欧美精品永久| 桃红色精品国产亚洲av| 听说在线观看完整版免费高清| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲中文字幕日韩| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品 欧美亚洲| 无人区码免费观看不卡| 久久亚洲真实| 成人午夜高清在线视频 | 亚洲精品色激情综合| 亚洲第一av免费看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 在线观看免费视频日本深夜| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 男男h啪啪无遮挡| 中文字幕久久专区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 三级毛片av免费| 一区二区三区精品91| 国产成人精品无人区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日韩三级视频一区二区三区| av在线播放免费不卡| 亚洲 国产 在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲av成人一区二区三| 一级毛片女人18水好多| 在线播放国产精品三级| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日本免费a在线| av有码第一页| 亚洲成人国产一区在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 波多野结衣高清无吗| 老汉色∧v一级毛片| 午夜福利高清视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久99热这里只有精品18| 欧美在线黄色| 久久天堂一区二区三区四区| 久久久国产欧美日韩av| 91字幕亚洲| 久久久久久九九精品二区国产 | 欧美日本视频| 国产熟女xx| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲三区欧美一区| 91九色精品人成在线观看| 在线国产一区二区在线| 国产视频一区二区在线看| 日韩欧美国产一区二区入口| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产又爽黄色视频| 不卡av一区二区三区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 动漫黄色视频在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 欧美日韩精品网址| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 曰老女人黄片| 欧美乱码精品一区二区三区| 中文资源天堂在线| 白带黄色成豆腐渣| 国产一区二区三区视频了| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久香蕉精品热| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲五月色婷婷综合| 老熟妇仑乱视频hdxx| 男人舔奶头视频| 亚洲全国av大片| av中文乱码字幕在线| 少妇粗大呻吟视频| 制服诱惑二区| 国产av又大| 久久这里只有精品19| 国产色视频综合| 成年人黄色毛片网站| 国产亚洲av嫩草精品影院| 人人妻人人澡人人看| 18禁美女被吸乳视频| 免费搜索国产男女视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 在线免费观看的www视频| 国产精品,欧美在线| 免费av毛片视频| 国产av不卡久久| 大型av网站在线播放| 1024手机看黄色片| 最新在线观看一区二区三区| 欧美一级毛片孕妇| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲欧美精品综合久久99| 91麻豆av在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 可以在线观看毛片的网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 夜夜爽天天搞| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99精品欧美一区二区三区四区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 51午夜福利影视在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜福利在线观看吧| 人人妻人人澡人人看| 天堂影院成人在线观看| 亚洲第一电影网av| 中文在线观看免费www的网站 | 后天国语完整版免费观看| 一本久久中文字幕| 黄片大片在线免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精华一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看| 日本免费a在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 免费观看精品视频网站| 我的亚洲天堂| 国产亚洲精品av在线| 女性被躁到高潮视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲真实伦在线观看| 日本 av在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| www日本黄色视频网| 免费看a级黄色片| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日韩欧美一区视频在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 国产又爽黄色视频| 亚洲激情在线av| av欧美777| 两个人免费观看高清视频| 国产av不卡久久| 亚洲七黄色美女视频| 黄片大片在线免费观看| 国内精品久久久久久久电影| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美性长视频在线观看| 国产99白浆流出| 1024香蕉在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 日本在线视频免费播放| 精品高清国产在线一区| 国产精品国产高清国产av| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产不卡一卡二| 欧美黑人欧美精品刺激| 高清毛片免费观看视频网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 成年人黄色毛片网站| 久久久久国内视频| 天天添夜夜摸| 国产精品 国内视频| 日本 欧美在线| 深夜精品福利| 十八禁网站免费在线| 日本黄色视频三级网站网址| 精品不卡国产一区二区三区| 美国免费a级毛片| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲一区二区三区色噜噜| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 宅男免费午夜| 日韩成人在线观看一区二区三区| 岛国视频午夜一区免费看| av在线天堂中文字幕| 成年人黄色毛片网站| 免费在线观看成人毛片| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久 成人 亚洲| x7x7x7水蜜桃| 欧美另类亚洲清纯唯美| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品高清国产在线一区| 女性被躁到高潮视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲第一av免费看| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 叶爱在线成人免费视频播放| 嫁个100分男人电影在线观看| 在线观看日韩欧美| 精品日产1卡2卡| 中文字幕久久专区| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲国产精品999在线| 欧美三级亚洲精品| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 色精品久久人妻99蜜桃| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品久久久久久成人av| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产精品国产高清国产av| 成人国产一区最新在线观看| av在线播放免费不卡| 国产私拍福利视频在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 一本久久中文字幕| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲人成网站高清观看| 国产伦在线观看视频一区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一a级毛片在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲国产精品成人综合色| 久99久视频精品免费| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 我的亚洲天堂| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美日本亚洲视频在线播放| 天堂√8在线中文| 高清毛片免费观看视频网站| www.熟女人妻精品国产| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲欧美日韩无卡精品| 麻豆av在线久日| 校园春色视频在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产三级在线视频| 免费高清在线观看日韩| 99精品久久久久人妻精品| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 99国产精品一区二区三区| 国产爱豆传媒在线观看 | 亚洲 国产 在线| 嫩草影院精品99| 日本一区二区免费在线视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 一二三四在线观看免费中文在| 一a级毛片在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 一级作爱视频免费观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 午夜久久久在线观看| 不卡av一区二区三区| 91成人精品电影| 亚洲熟妇熟女久久| 真人一进一出gif抽搐免费| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产一区在线观看成人免费| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精华一区二区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美亚洲日本最大视频资源| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久精品成人免费网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 91老司机精品| 国内精品久久久久精免费| 在线国产一区二区在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜福利欧美成人| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产成人影院久久av| 亚洲一区高清亚洲精品| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 午夜福利一区二区在线看| 欧美黑人巨大hd| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩国内少妇激情av| 好男人电影高清在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲av片天天在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 色综合站精品国产| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日日夜夜操网爽| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 两个人免费观看高清视频| 日韩大码丰满熟妇| 怎么达到女性高潮| 亚洲真实伦在线观看| av有码第一页| 成年免费大片在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 性欧美人与动物交配| 人人妻人人看人人澡| 人人妻人人澡欧美一区二区| 黄频高清免费视频| av片东京热男人的天堂| 国内精品久久久久精免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久狼人影院| 国产成人精品无人区| 日韩欧美在线二视频| 国产精品1区2区在线观看.| 国产一区在线观看成人免费| 99国产精品一区二区蜜桃av| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 岛国在线观看网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成人国语在线视频| 美国免费a级毛片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美成人性av电影在线观看| 久久久国产成人精品二区| 亚洲三区欧美一区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 99热这里只有精品一区 | 婷婷精品国产亚洲av在线| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲七黄色美女视频| 校园春色视频在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 国产高清激情床上av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 日本三级黄在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 免费高清在线观看日韩| 久久伊人香网站| 亚洲成人久久性| or卡值多少钱| 日韩欧美在线二视频| 欧美三级亚洲精品| 黑丝袜美女国产一区| 人妻久久中文字幕网| 黄色 视频免费看| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲电影在线观看av| 嫩草影院精品99| 国产久久久一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 黄色视频不卡| 在线观看日韩欧美| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 一本久久中文字幕| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 波多野结衣高清无吗| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美一级a爱片免费观看看 | 午夜福利在线在线| cao死你这个sao货| 中文在线观看免费www的网站 | 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产精品一区二区三区四区久久 | 成人18禁在线播放| 日韩精品青青久久久久久| 男女视频在线观看网站免费 | 精品久久久久久久久久免费视频| 大型黄色视频在线免费观看| 精品免费久久久久久久清纯| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美黑人欧美精品刺激| www.精华液| 婷婷亚洲欧美| 99re在线观看精品视频| 国产色视频综合| 成人精品一区二区免费| 黄色女人牲交| 69av精品久久久久久| 亚洲国产精品久久男人天堂| 999久久久国产精品视频| 精品免费久久久久久久清纯| 九色国产91popny在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 婷婷精品国产亚洲av| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 国产av又大| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲片人在线观看| 午夜免费激情av| 91在线观看av| 国产免费av片在线观看野外av| 麻豆国产av国片精品| 一本大道久久a久久精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 给我免费播放毛片高清在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 99riav亚洲国产免费| 亚洲国产欧美网| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 91国产中文字幕| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 久久香蕉精品热| 久久久精品欧美日韩精品| svipshipincom国产片| 国产爱豆传媒在线观看 | 极品教师在线免费播放| 九色国产91popny在线| 久久久久久人人人人人| 国产精品av久久久久免费| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 韩国精品一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 脱女人内裤的视频| 丁香欧美五月| 一级作爱视频免费观看| av免费在线观看网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99久久综合精品五月天人人| 不卡一级毛片| 男女视频在线观看网站免费 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 韩国精品一区二区三区| 国产精品 国内视频| 国产伦在线观看视频一区| 天堂√8在线中文| 日本三级黄在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 十八禁人妻一区二区| 亚洲色图av天堂| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲人成网站高清观看| 国产三级在线视频| 99热6这里只有精品| 男人舔奶头视频| tocl精华| 亚洲电影在线观看av| 久久久久久久精品吃奶| 久久精品国产综合久久久| 久久精品影院6| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产主播在线观看一区二区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日韩免费av在线播放| 久久性视频一级片| av免费在线观看网站| 制服丝袜大香蕉在线| 色播在线永久视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 特大巨黑吊av在线直播 | 在线观看午夜福利视频| av电影中文网址| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产又爽黄色视频| 亚洲人成电影免费在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 午夜久久久在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 欧美日韩一级在线毛片| 麻豆成人av在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 麻豆一二三区av精品| 黄色视频不卡| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 成人18禁在线播放| 亚洲欧美日韩无卡精品| 三级毛片av免费| 亚洲精品中文字幕在线视频| 又大又爽又粗| 国产精品一区二区精品视频观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 黑人操中国人逼视频| 国产成年人精品一区二区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 最好的美女福利视频网| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 黑丝袜美女国产一区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 99在线人妻在线中文字幕| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| aaaaa片日本免费| 老汉色∧v一级毛片| 一区二区三区精品91| 国产亚洲av高清不卡| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美乱色亚洲激情| 99国产综合亚洲精品| netflix在线观看网站| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 久久中文看片网| 黄色丝袜av网址大全| 无遮挡黄片免费观看| 精品日产1卡2卡| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产单亲对白刺激| 亚洲片人在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 日韩精品青青久久久久久| 国产真实乱freesex| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 色播亚洲综合网| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久中文看片网| 亚洲天堂国产精品一区在线| 两个人免费观看高清视频| √禁漫天堂资源中文www| 国产主播在线观看一区二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久人人精品亚洲av| 亚洲免费av在线视频| 国产男靠女视频免费网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 免费看a级黄色片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美又色又爽又黄视频| e午夜精品久久久久久久| 亚洲美女黄片视频| 精品日产1卡2卡| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 天堂动漫精品| 成人欧美大片| 90打野战视频偷拍视频| netflix在线观看网站| 亚洲性夜色夜夜综合| 中文字幕精品免费在线观看视频| 91av网站免费观看| 757午夜福利合集在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美zozozo另类| 757午夜福利合集在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美日韩黄片免| 无人区码免费观看不卡| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲avbb在线观看| 深夜精品福利| 男男h啪啪无遮挡| 99久久无色码亚洲精品果冻|