高通量測(cè)序分析膽囊結(jié)石患者microRNA表達(dá)譜差異

楊斌，張捷，劉斌，吳韜，王強(qiáng)

高通量測(cè)序分析膽囊結(jié)石患者microRNA表達(dá)譜差異

楊斌1，張捷2Δ，劉斌1，吳韜1，王強(qiáng)1

目的 探討膽囊結(jié)石和非結(jié)石患者膽囊黏膜中miRNA表達(dá)譜的差異。方法 選取30例膽結(jié)石患者（結(jié)石組）和30例膽囊息肉患者（非結(jié)石組）的膽囊黏膜組織，采用Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行深度測(cè)序，比較2組的microRNA表達(dá)差異。對(duì)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行篩選與靶基因預(yù)測(cè)，并進(jìn)行GO和KEGG功能顯著性富集分析。熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 結(jié)石組和非結(jié)石組分別獲得2 215 832和1 424 770條序列，平均長(zhǎng)度22 nt。2組間顯著差異表達(dá)的miRNA共計(jì)17個(gè)，其中9個(gè)表達(dá)上調(diào)，8個(gè)表達(dá)下調(diào)。GO分析結(jié)果示靶基因富集于離子的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)、載脂蛋白結(jié)合、鈣離子通道激活、蛋白激酶活性等分子功能以及大分子的合成和代謝、類固醇激素生物合成和代謝等生物進(jìn)程。KEGG通路富集分析示靶基因多集中于癌癥相關(guān)通路，包括WNT、Hippo等信號(hào)通路。qRT-PCR結(jié)果示差異性miRNA的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果相一致。結(jié)論 差異表達(dá)的miRNA可能在膽囊結(jié)石的形成中具有重要作用。

微RNAs；基因表達(dá)譜；序列分析；膽囊結(jié)石??；差異表達(dá)；高通量測(cè)序；生物信息學(xué)

膽囊結(jié)石（GS）是臨床常見的消化系統(tǒng)疾病，患病人數(shù)逐年增加，各個(gè)年齡段均可發(fā)病。MicroR?NAs（miRNAs）是一類長(zhǎng)度為約為22 nt的非編碼RNA，廣泛分布在病毒、植物及高等哺乳動(dòng)物中［1］，作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式，miRNAs參與了人類近1/3的基因表達(dá)過程，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的調(diào)節(jié)作用［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)多種疾病中均存在miRNAs的差異表達(dá)［4］。但有關(guān)膽囊結(jié)石中miRNAs差異表達(dá)的研究較少，基于此，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)膽囊結(jié)石患者組織中差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行分析，為膽囊結(jié)石臨床治療提供可能的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月—2013年12月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科收治的30例膽結(jié)石患者膽囊黏膜組織（結(jié)石組），以同期收集的30例膽囊息肉患者膽囊黏膜組織（非結(jié)石組）做為對(duì)照。其中每組隨機(jī)取10例進(jìn)行高通量測(cè)序，全部標(biāo)本均用于PCR驗(yàn)證。結(jié)石組男13例，女17例，年齡29～70歲，中位年齡43歲。非結(jié)石組男14例，女16例，年齡24～65歲，中位年齡46歲，均為腺瘤性息肉。排除病毒性肝炎、糖尿病及代謝性疾病、近3個(gè)月內(nèi)膽囊炎急性發(fā)作及使用抗生素者。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并得到患者的知情同意。

1.2 主要試劑 Trizol試劑（Invitrogen，美國(guó)），Dnase I（Qia? gen，德國(guó)），SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR（Takara，日本），Small RNA Smaple Prep文庫構(gòu)建試劑盒（Illumina，美國(guó)）。

1.3 樣本總RNA提取及分離 Trizol法提取標(biāo)本總RNA， Dnase I處理RNA以消除DNA污染，所有步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。采用微量核酸蛋白測(cè)定儀（Agilent公司）、甲醛變性凝膠電泳和毛細(xì)管電泳對(duì)提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)檢，確?？俁NA的濃度及完整性達(dá)到測(cè)序要求。

1.4 測(cè)序文庫的構(gòu)建及測(cè)序 每例樣本取1.5 μg總RNA行15%尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后對(duì)18～32 nt片段進(jìn)行切割、洗脫、純化回收。采用Illumina公司的Small RNA Sample Prep Kit構(gòu)建小RNA文庫。純化后的小RNA序列采用T4 RNA連接酶將接頭引物分別連接至兩個(gè)文庫的序列5′端和3′端，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，PCR建立小RNA文庫。利用Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)該文庫進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.5 小RNA數(shù)據(jù)處理和信息分析 測(cè)序所得長(zhǎng)度為51 nt的小RNA序列通過去接頭、去除低質(zhì)量和污染序列，最終獲得18～32 nt的高質(zhì)量小RNA序列。統(tǒng)計(jì)小RNA的種類、數(shù)量及長(zhǎng)度分布，初步判斷小RNA質(zhì)量。采用mirdeep2軟件將所得小RNA序列與參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析，再將匹配序列分別與GenBank和Rfam 10.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，篩選出miRNA序列并分類注釋，分析其表達(dá)情況。

1.6 miRNA差異表達(dá)分析 將樣本中的miRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為TPM（Tags per million），應(yīng)用EdgeR軟件對(duì)2組樣本已知miRNA表達(dá)差異分析統(tǒng)計(jì)。將“差異倍數(shù)”絕對(duì)值≥2 且P＜0.05的miRNA定義差異表達(dá)的miRNA。差異倍數(shù)= log2（結(jié)石組miRNA標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)量/非結(jié)石組miRNA標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)量）。

1.7 GO和KEGG顯著性富集分析 首先利用miRanda-3.3a對(duì)表達(dá)差異的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，選取所預(yù)測(cè)的靶基因中能量值最低的10個(gè)基因。將所預(yù)測(cè)的靶基因映射到Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫中的各個(gè)條目中，計(jì)算映射到各條目的基因數(shù)，利用超幾何分布計(jì)算得到P值。滿足P≤0.05即為差異表達(dá)miRNA的靶基因中顯著性富集的GO條目。同時(shí)利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge?nomes）數(shù)據(jù)庫，將差異miRNA的靶基因進(jìn)行映射，采用與GO相同的計(jì)算方法獲得KEGG分析結(jié)果。

1.8 差異表達(dá)miRNA的驗(yàn)證 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qRT-PCR）對(duì)4個(gè)顯著性差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的可信性。rRNA U6作為內(nèi)參，miRNA檢測(cè)用上游特異性引物由蘇州金唯智公司合成，下游通用引物為試劑盒中特有。上游引物序列miR-192-5p：5′-GACCTAT?GAATTGACAGC-3′；miR-194-5p：5′-ACAGCAACTCCATGT?GG-3′；miR-133a-5p：5′-TTTGGTCCCCTTCAACC-3′；miR-146b-5p：5′-GAGAACTGAATTCCATAGG-3′。擴(kuò)增條件：95℃10 min；95℃10 s，60℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)值。實(shí)驗(yàn)在Roche LightCycler 480重復(fù)運(yùn)行3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各樣本序列分析及組成分布 原始序列經(jīng)過處理后，2組樣本所獲得的可用于分析的小RNA序列數(shù)量分別為2 215 832和1 424 770條。所獲得的序列長(zhǎng)度主要集中于18～22 nt，說明測(cè)序獲得的序列質(zhì)量較高，見圖1?？梢杂糜诤罄m(xù)的生物信息學(xué)分析。

Fig.1 Size distribution of sequenced small RNAs betwen 18-32 nt圖1 樣本中小RNA在18～32 nt范圍內(nèi)的長(zhǎng)度分布

2.2 差異性表達(dá)miRNAs的分析 見表1。結(jié)石組共獲得760個(gè)miRNAs成熟體序列，非結(jié)石組獲得668個(gè)miRNAs成熟體序列。2組587種miRNAs共同表達(dá)，進(jìn)一步分析結(jié)果顯示17個(gè)miRNAs呈顯著性差異表達(dá)。在差異性表達(dá)的miRNAs中，9種miRNAs表達(dá)上調(diào)，8種miRNAs表達(dá)下調(diào)。

Tab.1 Differentially expressed miRNAs表1 差異表達(dá)的miRNAs

2.3 GO和KEGG功能顯著性富集分析 GO的3個(gè)本體分別描述了基因的生物學(xué)過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）。GO分析結(jié)果示樣本在富集的分子功能上多集中于離子的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)、載脂蛋白結(jié)合、鈣離子通道激活、蛋白激酶活性等；在細(xì)胞進(jìn)程上多富集于大分子的合成和代謝，類固醇激素生物合成和代謝過程等，見表2。KEGG通路富集分析示，受miRNAs調(diào)控的靶基因參與了36條信號(hào)通路，這些通路中多集中于癌癥相關(guān)通路，包括Basal cell carcinoma、WNT、Hippo等信號(hào)通路，見表3。

Tab.2 GO analysis of targets genes of differential expressed miRNAs表2 差異miRNAs的靶基因GO功能富集分析

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證 采用qRT-PCR對(duì)2個(gè)上調(diào)表達(dá)的miRNAs（miR-192-5p和miR-194-5p）和2個(gè)下調(diào)表達(dá)的 miRNAs（miR-133a-5p和 miR-146b-5p）進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示4個(gè)miRNA的表達(dá)變化趨勢(shì)與高通量測(cè)序的結(jié)果基本一致（t值分別為46.354、104.623、26.284、84.434，均P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)了高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，見圖2。

Tab.3 KEGG analysis of targets genes of differential expressed miRNAs表3 差異miRNAs的靶基因KEGG功能富集分析

Fig.2 The expression ratio of differential miRNAs in two groups圖2 2組樣本中的miRNAs相對(duì)表達(dá)水平差異

3 討論

本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法，找出膽囊結(jié)石中差異表達(dá)的miRNA及可能的靶基因，將靶基因進(jìn)行功能分類，進(jìn)一步推測(cè)miRNA在膽囊結(jié)石中的功能和作用。研究發(fā)現(xiàn)了膽囊結(jié)石組樣本中呈顯著性差異表達(dá)的17個(gè)miRNAs，其中9種miRNAs表達(dá)水平上調(diào)，8種miRNA分子表達(dá)水平下調(diào)。qRT-PCR的結(jié)果也證實(shí)了與高通量測(cè)序結(jié)果相一致的miRNA表達(dá)變化。

本研究獲得的差異表達(dá)miRNA的靶基因在GO富集的分子功能上多集中于離子的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞進(jìn)程上多富集于大分子的合成和代謝，這也符合結(jié)石病的預(yù)期。Lammert等［5］在2001年提出了45條膽石病侯選基因，它們主要是脂類代謝相關(guān)蛋白及膽囊相關(guān)蛋白。本研究獲得的miRNA預(yù)測(cè)的靶基因基本上能涵蓋這45條候選基因，間接證明了測(cè)序結(jié)果的可靠性。

膽囊結(jié)石的發(fā)生發(fā)展是個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到多種信號(hào)通路，對(duì)任一通路的調(diào)控都可能對(duì)治療膽囊結(jié)石起到重要作用。本研究中顯著差異表達(dá)的部分miRNAs已被證實(shí)參與膽囊癌的調(diào)控，如miR-200與ZEB基因形成一個(gè)反饋通路進(jìn)而參與膽囊癌的發(fā)展進(jìn)程［6］。miR-146能夠改變程序性細(xì)胞死亡4（PDCD4）的表達(dá)，促進(jìn)膽囊上皮的轉(zhuǎn)化［7-8］。miR-34也被證實(shí)可能會(huì)調(diào)控腫瘤干細(xì)胞端粒酶長(zhǎng)度，進(jìn)而影響膽囊癌患者的預(yù)后［9］。盡管尚無miRNAs和膽囊結(jié)石發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的報(bào)道，但是從miRNA調(diào)控一些相關(guān)基因的研究中可間接發(fā)現(xiàn)其與膽囊結(jié)石的關(guān)聯(lián)性。如miR-145和miR-199a可以直接靶向調(diào)控黏蛋白-1（mucin-1）［10-11］；miR-200c和miR-150靶向調(diào)控mucin-4［12］。筆者前期的工作或是已經(jīng)報(bào)道的研究均顯示，mucin蛋白均與膽囊結(jié)石聯(lián)系緊密［13］。因此，本研究中篩選到的miRNAs可能通過某種或多種信號(hào)通路影響膽囊結(jié)石甚至膽囊癌的發(fā)生發(fā)展［14］。高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致的全貌分析成為可能。本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)成功篩選到一些與膽囊結(jié)石相關(guān)的差異表達(dá)的miRNAs，為膽囊結(jié)石成因的研究提供了新的思路和工作基礎(chǔ)。

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（2014-11-24收稿 2014-12-30修回）

（本文編輯 胡小寧）

Analysis of differential microRNA expression in patient with gallbladder stones through high-throughput sequencing technologies

YANG Bin1，ZHANG Jie2Δ，LIU Bin1，WU Tao1，WANG Qiang1
1 Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650032，China；
2 Department of hepatobiliary surgery，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University
△Corresponding Author E-mail：jason6677@hotmail.com

Objective To detect the differential expression profile of microRNAs between patients with or without gall?bladder stone.Methods Samples from 30 patients with gallbladder stones（GS）and 30 without gallbladder stones（GP）were collected，in which microRNAs expression profiles were examined using high-throughput sequencing instrument Illumi?na HiSeq 2500.MicroRNA sequences were obtained and compared to Genebank and Rfam database for classification.Differ?entially expressed microRNAs were screened，and their target genes were predicted.Significant enrichment analysis of GO and KEGG were performed.Real-time quantitative PCR was performed on selected miRNAs in order to validate their expres?sion.Results Clean tags were obtained from both GS group（n=2 215 832）and GP group（n=1 424 770）.A total of 17 mi?croRNAs were differentially expressed between GS and GP groups with statistical significance，among which 9 were up-regu?lated and 8 were down-regulated in GS group compared to those in GP group.GO（Gene ocology）analysis showed that target genes were enriched in ion binding and transport，apolipoprotein binding，calcium channel activity，protein kinase activity，steroid hormone biosynthesis and metabolism.KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）analysis is shown for the target genes enriched in cancer related pathways，including WNT，HIPPO pathways.qRT-PCR validation of some differen?tially expressed miRNAs confirmed the result of high-throughput data analysis.Conclusion The differential expression levels of microRNAs may play an important role in occurrence and development of gallbladder stones.

microRNA；gene expression profiling；sequence analysis；cholecystolithiasis；differential expression；highthrough sequencing；bioinformation

R657.4+2，R318.04

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.004

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2006C008Z）

1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科（郵編650032）；2昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科

楊斌（1981），主治醫(yī)師，碩士，主要從事肝膽胰疾病的防治研究

E-mail:jason6677@hotmail.com