甲基化調(diào)節(jié)miR-200b的表達(dá)及其對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖侵襲能力的影響

郭蓉，寧向紅，姜葵，張慶瑜

甲基化調(diào)節(jié)miR-200b的表達(dá)及其對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖侵襲能力的影響

郭蓉，寧向紅，姜葵，張慶瑜△

目的 體外研究基因miR-200b發(fā)生甲基化的不同程度及其表達(dá)量的差異對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803增殖、侵襲、凋亡及對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。方法 以正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞MGC-803為研究對(duì)象，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)2種細(xì)胞系中miR-200b的表達(dá)量；亞硫酸氫鈉修飾PCR（BSP）法檢測(cè)miR-200b啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。用不同濃度5-氮雜胞苷（5′-Aza-CdR）藥物處理MGC-803細(xì)胞72 h后，同法檢測(cè)miR-200b的表達(dá)量及啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平變化。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的藥物作用濃度和時(shí)間即（10 μmol/L，72 h）作為處理組。通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀測(cè)細(xì)胞侵襲能力；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡的分布情況；Western-blot檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)指標(biāo)E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9等的表達(dá)水平。結(jié)果 miR-200b在GES-1中表達(dá)量較MGC-803高（P=0.022）。啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平則與之相反（P=0.034）。藥物不同濃度作用后的MGC-803細(xì)胞系miR-200b表達(dá)量有隨濃度升高而升高的趨勢(shì)，作用濃度為10 μmol/L時(shí)miR-200b啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平較對(duì)照組低（P=0.043）。與對(duì)照組相比，處理組細(xì)胞晚期凋亡數(shù)增多；G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著增多，S期顯著減少；穿過(guò)Transwell小室細(xì)胞數(shù)顯著減少；Western-blot實(shí)驗(yàn)表明E-cad?herin表達(dá)量升高，N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9表達(dá)量降低。結(jié)論 miR-200b啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的不同可以影響其表達(dá)量，而miR-200b表達(dá)量的異常又與胃癌MGC-803細(xì)胞增殖、侵襲能力密切相關(guān)。

胃腫瘤；腺癌；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖；DNA甲基化；微RNA-200b

表觀遺傳學(xué)修飾包括DNA甲基化及組織蛋白乙酰化，它們?cè)谀[瘤形成和發(fā)展過(guò)程中有很重要的作用，尤其是DNA甲基化［1］。DNA甲基化是在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG 2個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基形成5-甲基胞嘧啶后對(duì)腫瘤進(jìn)行調(diào)節(jié)的。研究已證實(shí)，基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生異常甲基化后可對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生一定的影響，如P21基因啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化后導(dǎo)致表達(dá)量降低，同時(shí)增加了乳腺癌的發(fā)病率［2］；miR-200b和甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑共同作用可以在不同程度上阻止間質(zhì)表型肝細(xì)胞癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移［3］。Micro-RNAs是由19～22個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，主要結(jié)合在目標(biāo)mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR），通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)［4］。Mi-RNAs的表達(dá)模式具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性，在不同組織、不同發(fā)育階段中表達(dá)水平有顯著差異，是調(diào)控其他功能基因表達(dá)的重要分子［5］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-200b基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的程度與基因表達(dá)量的關(guān)系，及基因甲基化作用對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 GES-1細(xì)胞購(gòu)自北京腫瘤細(xì)胞庫(kù)，MGC-803細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。甲基化作用抑制劑5-氮雜胞苷（5′-Aza-CdR）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TRIZOL試劑購(gòu)自美國(guó)Ambion公司，dNTP mixture、反轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）、RNase抑制劑購(gòu)自大連TaKaRa公司，熒光定量miRNAPCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄引物及RT-PCR引物購(gòu)自上海吉瑪公司。NI-細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒，處理、純化回收DNA的EpiTect Bisulfite kit，No.59104試劑盒購(gòu)自QIA?GEN公司，pMD?18-T Vector Cloning Kit購(gòu)自大連TaKaRa公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用南京凱基公司Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司，E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cellsignal公司，相應(yīng)二抗均購(gòu)自中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 GES-1、MGC-803細(xì)胞接種于含10%胎牛血清（56℃水浴滅活40min）DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃含有5%CO2的濕潤(rùn)空氣恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。第一部分：驗(yàn)證miR-200b 在GES-1、MGC-803細(xì)胞中的表達(dá)量差異。第二部分：用不同濃度5′-Aza-CdR（2.5、5、7.5、10 μmol/L）作用胃癌MGC-803細(xì)胞72 h后，檢測(cè)miR-200b表達(dá)量差異，并選擇miR-200b升高較明顯所對(duì)應(yīng)藥物濃度作為處理組進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組為相同條件下空白對(duì)照。第三部分：驗(yàn)證miR-200b表達(dá)量差異在調(diào)節(jié)增殖、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。

1.2.2 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-200b表達(dá)量變化 TRIZOL法提取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的GES-1和處理前后的MGC-803細(xì)胞總RNA，依照試劑盒說(shuō)明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，所用引物為特異miR-200b逆轉(zhuǎn)錄引物以及內(nèi)參U6逆轉(zhuǎn)錄引物，得到cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：95℃5 min，37℃1 h。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)miR-200b表達(dá)量變化。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5min，95℃ 30s，62℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)，得出各組Ct值，所得結(jié)果按照2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾測(cè)序PCR（BSP）法檢測(cè)miR-200b基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平變化 用NI-細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取GES-1、MGC-803細(xì)胞系基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。使用QIAGEN（EpiTect Bisulfite kit，No.59104）試劑盒處理、純化回收DNA并作為模板，設(shè)計(jì)并驗(yàn)證合成引物4對(duì)進(jìn)行PCR，從中優(yōu)選1對(duì)引物，其特異性引物序列：上游5′-GTATTTAGAGGAAGATGAGATG-3′，下游5′-AACCTAACTTATTAATTAACCTAC-3′，產(chǎn)物372 bp。擴(kuò)增條件為95℃ 5min，95℃ 40s、54℃ 40s、72℃ 50s，共40個(gè)循環(huán)，72℃ 10min，產(chǎn)物回收后使用TaKaRa（pMD?18-T Vector Cloning Kit）連結(jié)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，搖菌后涂板（加Amp的LB固體培養(yǎng)基），做菌落PCR檢測(cè)，挑取陽(yáng)性菌放入加有Amp的LB液體培養(yǎng)基搖菌，過(guò)夜后測(cè)序。使用BiQAnalyzer軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行CpG島甲基化水平分析。

1.2.4 細(xì)胞凋亡測(cè)定 選擇生長(zhǎng)在直徑為60 mm培養(yǎng)皿中MGC-803細(xì)胞系處理組和對(duì)照組，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用不含EDTA的胰酶消化收集于EP管中，1 000 r/min離心5 min后棄去上清，PBS洗滌2～3次后收集細(xì)胞（1～5）×105個(gè)/mL，按說(shuō)明書加入凱基凋亡試劑盒中試劑，室溫避光反應(yīng)5～15 min，立即于real-tec流式細(xì)胞儀中于488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 細(xì)胞周期測(cè)定 選擇生長(zhǎng)在6孔板中的MGC-803細(xì)胞系處理組和對(duì)照組，常規(guī)消化離心細(xì)胞，收集于EP管中，之后于EP管中加入約500 μL預(yù)冷的75%乙醇溶液，于4℃冰箱固定過(guò)夜，離心后棄去乙醇，PBS洗滌2次，加入300 μL PI溶液。避光染色20 min后，1 000 r/min離心5 min，棄去染料，PBS洗滌后于流式細(xì)胞儀488 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布情況。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 在8 μm小孔聚碳酸酯濾膜的培養(yǎng)小室上鋪用預(yù)冷無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的Matrigel機(jī)制膠（Matrigel∶DMEM=1∶2）30 μL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育待其凝固，接種150 μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋MGC-803細(xì)胞約50 000個(gè)，下室加入500 μL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，棄去上室液體，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，蘇木精染色5 min，PBS洗滌。DP-70熒光相差倒置顯微鏡（×100）采集圖像，隨機(jī)讀取3個(gè)視野，計(jì)算穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)并取平均值。

1.2.7 Western-blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)水平 分別收集對(duì)照組及處理組MGC-803細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液RIPA裂解提取細(xì)胞總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒壓80 V電轉(zhuǎn)移至PVDF印跡膜。膜封閉液封閉1 h后，加入一抗E-cad?herin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9、GAPDH（1∶1 000稀釋）4℃孵育過(guò)夜。次日室溫復(fù)溫30 min后PBST洗膜，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000稀釋）室溫孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)采集成像。GAPDH蛋白作為內(nèi)參。以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/同一樣本內(nèi)參條帶灰度值計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組之間差異比較使用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；2組間比較采用成組t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GES-1和MGC-803細(xì)胞miR-200b的表達(dá)水平 GES-1細(xì)胞中miR-200b表達(dá)高于MGC-803細(xì)胞（3.84±0.43 vs 1.98±0.29，t=6.709，P=0.022）。

2.2 不同濃度處理對(duì)MGC-803中miR-200b表達(dá)水平的影響 不同濃度（0、2.5、5.0、7.5、10 μmol/L）5′-Aza-CdR處理MGC-803細(xì)胞72 h后miR-200b表達(dá)量分別為1.00±0.00、2.35±0.39、2.28±0.26、3.36±0.01、5.98±0.63，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.283，P＜0.01），以10 μmol/L升高較為顯著。

2.3 GES-1和MGC-803細(xì)胞miR-200b啟動(dòng)子區(qū)甲基化差異 MGC-803中miR-200b啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化程度較GES-1顯著升高（［93.80±6.00）%vs （78.10±7.60）%，t=5.636，P=0.034］。

2.4 MGC-803處理組和對(duì)照組中miR-200b啟動(dòng)子區(qū)甲基化差異 10 μmol/L 5′-Aza-CdR處理組細(xì)胞甲基化程度較對(duì)照組降低（［87.50±11.30）%vs （93.80±6.00）%，t=4.642，P=0.043］。GES-1和MGC-803對(duì)照組及處理組的miR-200b啟動(dòng)子區(qū)甲基化位點(diǎn)圖，見(jiàn)圖1。

Fig.1 Methylation profiles around the transcriptional start site of miR-200b in GES-1 and MGC-803圖1 GES-1和MGC-803對(duì)照組及處理組的miR-200b啟動(dòng)子區(qū)甲基化位點(diǎn)圖

2.5 去甲基化處理后MGC-803細(xì)胞凋亡水平變化結(jié)果 MGC-803處理組較對(duì)照組晚期細(xì)胞凋亡率增加（［5.25±0.32）%vs（3.52±0.18）%，t=9.636，P= 0.011］，見(jiàn)圖2。

Fig.2 Ratio of apoptotic cells in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells圖2 處理組和對(duì)照組MGC-803細(xì)胞系凋亡率

2.6 去甲基化處理后 MGC-803細(xì)胞周期變化 MGC-803處理組較對(duì)照組q細(xì)胞大多被阻滯在G0/G1期，而G2/M期、S期的細(xì)胞數(shù)明顯減少（均P＜0.01），見(jiàn)圖3、表1。

Fig.3 Cell cycle profiles of MGC-803 after 5′-Aza-CdR treatment圖3 5′-Aza-CdR處理后的MGC-803細(xì)胞周期圖

Tab.1 The percentages of various cell phages in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表1 處理組和對(duì)照組MGC-803細(xì)胞在不同細(xì)胞周期的比例 （n=3，%，±s）

Tab.1 The percentages of various cell phages in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表1 處理組和對(duì)照組MGC-803細(xì)胞在不同細(xì)胞周期的比例 （n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01

組別對(duì)照組處理組t G0/G1期56.44±1.64 67.63±1.89 19.580＊＊G2/M期9.32±0.15 12.91±0.21 4.532＊＊S期34.24±0.88 19.46±0.45 7.357＊＊

2.7 去甲基化處理后MGC-803細(xì)胞系侵襲能力變化 與對(duì)照組相比，處理組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)顯著減少，且每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組（［11.03± 0.93）個(gè) vs（18.82±1.36）個(gè)，t=6.722，P=0.021］，見(jiàn)圖4。

2.8 MGC-803細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)變化 處理組MGC-803細(xì)胞中E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），而N-cad?herin、ZEB1、Slug、MMP9較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5、表2。

Fig.4 The invasiveness of MGC-803 after 5′-Aza-CdR treatment圖4 5′-Aza-CdR處理MGC-803細(xì)胞后侵襲能力的變化（×100）

Fig.5 The protein expression levels of E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug，MMP9 in 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells圖5 MGC-803處理組及對(duì)照組中E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9蛋白表達(dá)水平

Tab.2 Comparison of protein expression levels of E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug，MMP9 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表2 MGC-803處理組及對(duì)照組中E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug，MMP9 5′-Aza-CdR treated and control MGC-803 cells表2 MGC-803處理組及對(duì)照組中E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、Slug、MMP9蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別對(duì)照組處理組t E-cadherin 0.22±0.03 1.81±0.04 11.452＊＊N-cadherin 1.93±0.02 0.86±0.01 5.365＊＊ZEB1 1.58±0.01 0.64±0.05 6.941＊＊Slug 1.62±0.06 0.29±0.07 8.758＊＊MMP9 1.58±0.02 0.16±0.03 9.280＊＊

3 討論

3.1 基因異常甲基化的作用 異常DNA甲基化和組織蛋白乙?；潜碛^遺傳學(xué)修飾中最主要的兩部分，在基因致癌與抑癌研究中有重要作用［6］。其能在不改變DNA序列的前提下，改變生物的遺傳表象［7］。當(dāng)基因發(fā)生異常甲基化時(shí)，常導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默，使重要基因如抑癌基因、DNA修復(fù)基因等喪失功能，從而導(dǎo)致正常細(xì)胞的生長(zhǎng)分化調(diào)控失常以及DNA損傷不能被及時(shí)修復(fù)，這與多種腫瘤形成密切相關(guān)［8］。MiR-200b是長(zhǎng)度僅有19～22 nt的核苷酸片段。本次研究證實(shí)miR-200b上游啟動(dòng)子區(qū)有CpG島聚集區(qū)并且這些區(qū)域有甲基化現(xiàn)象存在，啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化后，影響基因正常轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，導(dǎo)致其表達(dá)量降低；同時(shí)也可以在不同程度上增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞MGC-803的侵襲性和增殖性。

3.2 5′-Aza-CdR的去甲基化作用 5′-Aza-CdR 是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的抑制劑，它可以和DNMT發(fā)生共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致酶活性降低，進(jìn)而影響甲基化發(fā)生率，并使由于甲基化原因?qū)е鲁聊幕蛑匦卤磉_(dá)。本研究證實(shí)5′-Aza-CdR可以部分逆轉(zhuǎn)miR-200b啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，從而使由于異常甲基化作用導(dǎo)致的低表達(dá)狀態(tài)發(fā)生上調(diào)，進(jìn)而降低胃癌MGC-803細(xì)胞的惡性侵襲與增殖性。

3.3 EMT的發(fā)生受miR-200b表達(dá)量的影響 EMT被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移性腫瘤形成的最早的步驟［9］，同時(shí)也是組織重新塑造的關(guān)鍵因素。EMT的特點(diǎn)是：代表上皮標(biāo)志的指標(biāo)（如E-cadherin）消失，而代表間充質(zhì)標(biāo)志的指標(biāo)（如N-cadherin、ZEB1、Slug）上調(diào)［10］。研究表明，miR-200a的抑癌作用主要是通過(guò)抑制正常EMT，其具體機(jī)制是通過(guò)作用于其靶點(diǎn)ZEB1/ZEB2，降低對(duì)E-cadherin的抑制作用，促進(jìn)E-cadherin高表達(dá)［11］。本研究證實(shí)，受不同程度甲基化影響的miR-200b表達(dá)量也可以影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。

本研究表明，miR-200b啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化狀態(tài)是導(dǎo)致其低表達(dá)的主要原因，而在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的作用下，可使低表達(dá)量的miR-200b發(fā)生上調(diào)。對(duì)于在胃癌細(xì)胞MGC-803中充當(dāng)抑癌基因的miR-200b來(lái)說(shuō)，其甲基化狀態(tài)的不同會(huì)直接影響其表達(dá)量，進(jìn)而間接影響其抑癌作用，導(dǎo)致MGC-803的惡性增殖和侵襲性發(fā)生改變，并影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。因此，基因異常甲基化的相關(guān)研究在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)防及治療方面具有重要意義。

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（2014-11-12收稿 2015-01-21修回）

（本文編輯 李鵬）

Methylation of miR-200b and its effects on proliferation，invasion of gastric cancer cell line MGC-803

GUO Rong，NING Xianghong，JIANG Kui，ZHANG Qingyu△
Department of Gastroenterology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China
△Corresponding Author E-mail：zhangqy@tijmu.edu.cn

Objective To investigate the effect of expression level and methylation level of miR-200b on proliferation，invasion and apoptosis of gastric cancer cell line MGC-803 in vitro.Methods Normal human gastric epithelium cell line GES-1，and gastric cancer cell line MGC-803 cells were cultured and harvested to extract total RNA.Then miR-200b ex?pression level was examined via q-PCR；Methylation in promoter of miR-200b was revealed by Bisulphite PCR.MGC-803 cells were treated with different concentrations of 5′-Aza-CdR to test its effect on miR-200b expression and methylation of its promotor.The effect of its treatment at 10 μmol/L for 72 h on invasion，proliferation and apoptosis of both cell lines were detected by Transwell assay，F(xiàn)low cytometry and apoptosis assay respectively.The gene related to EMT（epithelial-mesen?chymal transition）such as E-cadherin，N-cadherin，ZEB1，Slug were checked by Western blot.Results The expression of miR-200b in GES-1 is higher than that in MGC-803（P=0.022）.The methylation level in promoter region of miR-200b in GES-1 is lower than that in MGC-803（P=0.034）.After treated with 5′-Aza-CdR，the expression of miR-200b in MGC-803 cell was up-regulated in a timely dependent manner.On the contrary，the methylation in promoter of mirR-200b were down-regulated when 5′-Aza-CdR were added at 10 μmol/L（P=0.043）.What's more，5′-Aza-CdR administration increas?es cell apoptosis especially in aged cells and delays cell cycle at G0/G1which in turn decrease ratio of cells in S phages.5′-Aza-CdR treatment also decreased invasiveness and induced expression of E-cadherin，as well as down regulated the ex?pressions of N-cadhrin，ZEB1，Slug and MMP9 in MGC-803 cells.Conclusion Expression of miR-200b could be affected by methylation of promoter of miR-200b and in turn regulate proliferation and invasion of gastric cells in vitro.

stomach neoplasms；adenocarcinoma；cell apoptosis；cell proliferation；DNA methylation；microRNA-200b

R735.2，R349.6

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172356）；天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（10JCZDJC18500）

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科（郵編300052）

郭蓉（1987），女，碩士在讀，主要從事胃癌發(fā)病機(jī)制研究

△E-mail：zhangqy@tijmu.edu.cn