麻類脫膠高效菌株DCE01的Pel4I8基因克隆與表達(dá)

李琦，成莉鳳，曾潔，劉朝陽，劉正初，*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙410128;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205;3.湖南利爾康生物股份有限公司，湖南岳陽414100)

纖維作物的生物脫膠 (例如苧麻脫膠)關(guān)鍵控制因素之一就是果膠酶[1]。果膠酶是一類能夠降解果膠物質(zhì)的生物酶的總稱，是一種重要的工業(yè)酶制劑。果膠酶還廣泛應(yīng)用于果汁澄清、植物提取、廢水處理、紙漿漂白[2]等工業(yè)領(lǐng)域。按照作用底物的不同，果膠酶可以分為果膠甲基半乳糖醛酸酶 (PMG)、聚半乳糖醛酸酶 (PG)、果膠裂解酶 (PL)、聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)、果膠酯酶或果膠甲酯酶 (PE)、原果膠酶等。按照酶作用的最適pH情況，又分為酸性果膠酶、中性果膠酶與堿性果膠酶。為適應(yīng)工業(yè)化應(yīng)用的高要求，果膠酶的研究熱點(diǎn)正逐步由菌種篩選、酶學(xué)性質(zhì)測定、分離純化研究轉(zhuǎn)向基因工程、蛋白質(zhì)工程等分子生物學(xué)內(nèi)容。發(fā)掘天然優(yōu)秀菌株中的優(yōu)質(zhì)果膠酶基因，是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)工作之一。

實(shí)驗室篩選到了擁有14個果膠酶基因的麻類脫膠高效菌株DCE01。為了更好的研究各果膠酶的特性，采用PCR技術(shù)克隆了該菌株的一個果膠酶基因Pel4I8，將其與大腸桿菌表達(dá)載體pET－28a連接，在E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行了表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株DCE01由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所工程酶項目組提供;E.coli BL21(DE3)購自Novagen公司;載體pET－28a購自TransGen公司;聚半乳糖醛酸鈉、橘子果膠 (不同酯化度)購自Sigma公司;高保真聚合酶購自TransGen公司;UNIQ－10柱式細(xì)菌基因組等試劑盒購自上海生工公司;DNA Marker購自Tiangen公司;其他常規(guī)生化試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)。

PCR儀購自BioRad公司;SPX－250B型生化培養(yǎng)箱購自上海博訊公司;LDZX－50KBS型不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

DCE01菌種的活化[3]方法:從斜面保藏菌種挑取一環(huán)接種到5mL改良肉湯培養(yǎng)基，充分懸勻，35℃ 靜置培養(yǎng)5－8h。稀釋涂布固體改良肉湯培養(yǎng)基，35℃靜置培養(yǎng)18－20h，分離單菌落。挑選生長旺盛的單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)基，35℃，180r/min培養(yǎng)15－18h，供基因組DNA提取或其他用途。

1.2.2 基因組DNA的提取

參照UNIQ－10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 果膠酶pel4I8基因的擴(kuò)增

采用軟件Primer premier 5設(shè)計引物。上游引物帶BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物帶Hand III酶切位點(diǎn)。

以DCE01菌株基因組DNA為模板，擴(kuò)增體系參照試劑說明書。擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為:95℃ 預(yù)變性4.0 min，94℃變性30s、55℃退火30 s、72℃延伸1.0 min，共30個循環(huán)，72℃保溫10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒提取、DNA酶切、連接、轉(zhuǎn)化、DNA片段回收等操作按相關(guān)試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.4 果膠酶的誘導(dǎo)表達(dá)及粗酶液的制備

挑取陽性基因工程菌株接種培養(yǎng) (培養(yǎng)條件:37℃、220 r/min)。當(dāng)OD600達(dá)到0.6，添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。發(fā)酵液在3500 r/min，4℃的條件下離心10 min，分別收集菌體和上清液。上清液即為胞外酶液。

用適量預(yù)冷的生理鹽水洗滌菌體并重懸，在4℃下用超聲波破碎儀破壁后，14℃、10000 r/min條件下離心10 min，收集上清液即為胞內(nèi)酶液。

1.2.5 SDS－PAGE電泳

采用12%的分離膠和5%的濃縮膠。根據(jù)蛋白質(zhì)樣品的濃度，上樣量為5.0－20.0μL。濃縮膠的電壓為100V，電流10mA。待進(jìn)入分離膠后，電壓不變，電流調(diào)節(jié)為25mA。

1.2.6 果膠酶活力單位定義

50℃、pH值9.0條件下，底物每分鐘釋放出相當(dāng)于1.0μmol半乳糖醛酸的還原糖所需的酶量為1個酶活力單位，以“U/mL”表示。

1.2.7 果膠酶酶學(xué)性質(zhì)分析

在50℃下測定重組果膠酶在pH 7.5－11.0時的酶活性，確定其最適pH值;在pH 9.0條件下，分別測定其在40－65℃條件下的酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

以基因組DNA為模板，獲得的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示:果膠酶基因Pel4I8電泳條帶清晰，目的基因克隆成功。測序結(jié)果標(biāo)明，該基因含有1632個堿基。

圖1 果膠酶基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of pectate lyase gene

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與酶切

提取轉(zhuǎn)化后陽性菌株的質(zhì)粒，并在37℃酶切30 min。以質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定。用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物及陽性克隆菌種的質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。結(jié)果表明:果膠酶基因Pel4I8已經(jīng)轉(zhuǎn)化成功，條帶大小與目標(biāo)基因相符。

圖2 質(zhì)粒PCR鑒定與擴(kuò)增檢測Fig.2 Detection of recombinants by PCR

2.3 誘導(dǎo)產(chǎn)酶結(jié)果

重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8h、21h后的蛋白質(zhì)SDS－PAGE電泳結(jié)果表明:第21h的條帶較第8小時的明顯，這說明蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時間的延長而增多。果膠酶Pel4I8基因編碼543個氨基酸，預(yù)測的分子量約為63kDa。

圖3 果膠酶SDS－PAGE電泳Fig.3 SDS－PAGE of recombinant pectate lyase

2.4 堿性果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)

生物酶的作用隨著溫度和pH的變化而變化，一般來說，溫度越高，催化效果越好，但是溫度過高，又會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，甚至使蛋白質(zhì)失去活性。結(jié)果顯示，該酶的最佳反應(yīng)溫度為55℃、最佳反應(yīng)pH為pH 9.5。

圖4 溫度對重組果膠酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of recombinant pectate lyase

圖5 重組果膠酶的pH值穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of recombinant pectate lyase

工業(yè)應(yīng)用中，人們常常通過比較酶活來評價一個酶的催化效率。然而，酶活的檢測往往受到底物等多種因素的影響。這在果膠酶Pel4I8上尤為明顯。分別采用四種酯化度各不相同的橘子果膠為底物，檢測到的酶活相差較大。用酯化程度在55%－70%的橘子果膠作底物檢測時酶活最高，以酯化程度≥85%的橘子果膠為底物時，幾乎檢測不到酶活。

圖6 不同底物對酶活力的影響Fig.6 Effect of substrates on enzyme activity

3 討論

自然界中的產(chǎn)果膠酶微生物往往可以分泌多種不同類型的果膠酶，這些酶的酶學(xué)特性往往有很大的差別，認(rèn)真分析和研究這些差異性，既是拓展工業(yè)酶精細(xì)化應(yīng)用的需要，也是開發(fā)新型高效酶制劑的基礎(chǔ)。酶法脫膠中更偏向于選擇堿性果膠酶而不是酸性果膠酶，因為堿性環(huán)境下纖維素降解會受到抑制[4]。在麻類脫膠工序中，果膠酶與果膠酶之間有協(xié)同作用，果膠酶與其它酶復(fù)合使用，更能降低能耗，提高生產(chǎn)性能。Kaur等在紅麻生物制漿中利用果膠酶與木聚糖酶協(xié)同作用，提高了紙漿性能[5]。因此，實(shí)際應(yīng)用中，既要考慮果膠酶的酶學(xué)特性，還要考慮起協(xié)同作用的其它酶制劑的酶學(xué)特性，只有各酶種的特性類似，組合使用時才能發(fā)揮最佳效率，否則，會或多或少降低某一種酶的催化效率，造成浪費(fèi)。

進(jìn)行蛋白表達(dá)時，有些胞內(nèi)酶不能正確折疊和修飾，還會形成包涵體，即使純化出來也不一定能成功復(fù)性[6]。據(jù)報道，采用pEASY－E1載體進(jìn)行該酶基因的表達(dá)時，尚未檢測到胞內(nèi)酶活性和胞外酶活性[3]，而采用pET－28a載體時，兩者均檢測到了活性。表達(dá)載體的選擇可能對該酶的表達(dá)影響較大。

通過Blast序列分析發(fā)現(xiàn)，在核酸序列上，Pel4I8基因與來自Dickeya dadantii 3937的pelW基因[7]相似程度為93%，有109個差異點(diǎn)，而在氨基酸序列上的差異性要小一些，有9個氨基酸不同，相似度為97%。

據(jù)報道，盡管不同來源的果膠酶酶學(xué)性質(zhì)存在差異，但是，大部分堿性果膠酶最適pH值為8.0～l0.0，最適溫度范圍為50～60℃[8]。Li Zuming等[9]報道的果膠酶最適反應(yīng)pH值為10.0;徐偉等報道的果膠酶最適pH值為9.0～9.5，在pH 7.0～10.0之間催化性質(zhì)較穩(wěn)定;最適作用溫度范圍為45～55℃[10]。本研究中的果膠酶最適pH值為9.5，但在pH 9.0及10.0時，酶活僅為高峰時的61%和42%，這說明外部pH對酶的影響較大。在40－55℃溫度區(qū)間，酶活穩(wěn)定上升，最適溫度為55℃，這與已報道的研究相吻合。

工業(yè)應(yīng)用中，用酶環(huán)境較復(fù)雜，溫度和pH一般都有一定的波動范圍，這對工業(yè)酶的推廣與普及是一個挑戰(zhàn)。設(shè)計一個在較寬的溫度和pH范圍內(nèi)相對穩(wěn)定的酶蛋白是今后工業(yè)酶制劑開發(fā)的一個方向，此外，還將加強(qiáng)提高酶的表達(dá)量及催化效率方面的研究，為該酶的工業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

[1]鄭科，劉正初，段盛文，等.果膠酶在麻類脫膠中的應(yīng)用及其作用機(jī)理[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2012，2(6):404－410.

[2]Murad HA，Azzaz HH.Microbial pectinases and ruminant nutritior[J].Research Journal of Microbiology，2011，6(3):246－269.

[3]成莉鳳.DCE－01菌株果膠酶基因克隆與表達(dá)及其多樣性研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[4]白延坤，劉秉鉞，何連芳.韌皮纖維生物脫膠的研究進(jìn)展[J].造紙科學(xué)與技術(shù)，2006，25(2):34－38.

[5]Kaur A，Mahajan R，Singh A，et al.Application of cellulase－free xylano－pectinolytic enzymes from the same bacterial isolate in biobleaching of kraft pulp [J].Bioresour Technol，2010，101(23):9150 －9155.

[6]Jayani RS，Saxena S，Gupta R.Microbial pectinolytic enzymes:A review [J].Process Biochemistry，2005，40(9):2931－2944．

[7]Glasner JD，Yang CH，Reverchon S，et al.Genome sequence of the plant－pathogenic bacterium Dickeya dadantii 3937 [J].Journal of Bacteriology，2011，193(8):2076–2077.

[8]Pedrolli DB，Monteiro AC，Gomes E，et al.Pectin and pectinases:production，characterization and industrial application of microbial pectinolytic enzymes[J].The Open Biotechnology Journal，2009，7(3):9 －18.

[9]Li Zuming，Bai Zhihui，ZhangBaoguo，et al.Purification and characterization of alkaline pectin lyase from a newly isolated Bacillus clausii and its application in elicitation of plant disease resistance [J].Applied Biochemistry Biotechnology，2012，167(8):2241－2256.

[10]徐偉，付大偉，姚曉靜.基因工程菌Escherichia coli BL21/pET－pel重組果膠酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品科學(xué)，2014，35(23):245－248.