自污染染料中篩選的菌對(duì)顏料紫1的脫色

胡翠英，沈玉婷，李良智，錢(qián)瑋，郭偉強(qiáng)

（蘇州科技學(xué)院化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州215009；江蘇省環(huán)境功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 蘇州 215009）

隨著染料和印染工業(yè)的發(fā)展，大量的印染廢水排放到環(huán)境中，成為當(dāng)前主要的水體污染源之一。染料廢水處理的重點(diǎn)和難點(diǎn)都體現(xiàn)在色度的消除（即脫色）。目前對(duì)染料脫色的方法較多，如吸 附[1-3]、絮凝[4-5]、化學(xué)氧化[6-7]、生物處理等。其中生物處理由于其具有低消耗、環(huán)境友好的優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注。常見(jiàn)生物處理涉及的菌主要有：真菌，如雙孢菇對(duì)偶氮染料的降解[8]、白腐真菌對(duì)活性紅等5種染料的脫色[9]；細(xì)菌，如Bacillus cohniiMTCC 3616對(duì)偶氮染料的降解[10]、蒼白桿菌對(duì)孔雀綠的降解[11]、Leucobactersp.對(duì)深藍(lán)K-R、活性紅等的脫色[12]；混合菌[13]等。從機(jī)制上講，上述菌種有的是對(duì)染料降解脫色，有的是吸附脫色。當(dāng)然也有的只提到脫色，但脫色并不總意味著對(duì)染料的降解，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步分析[14]?？偟恼f(shuō)來(lái)，微生物菌種對(duì)于染料的降解或者脫色，在實(shí)際工業(yè)上的應(yīng)用還很少。因此，篩選和發(fā)現(xiàn)新的微生物菌株來(lái)處理染料廢水等對(duì)于環(huán)境化學(xué)工業(yè)具有重要的意義。

本工作首先對(duì)于實(shí)驗(yàn)室中偶然發(fā)現(xiàn)的廣告濃縮玫瑰紅染料（主要顯色原料顏料紫1）中長(zhǎng)出的菌進(jìn)行了篩選，獲得了一株純種菌株。研究采用分子生物學(xué)手段，對(duì)分離獲得的該菌株進(jìn)行提取其DNA分析，并利用生物信息學(xué)的方法，進(jìn)行序列相似性比較，構(gòu)建序列進(jìn)化樹(shù)，確定其與相關(guān)物種的親緣關(guān)系，進(jìn)行菌種鑒定。然后，通過(guò)在培養(yǎng)基中加入顏料紫1，探討該菌對(duì)顏料的脫色情況，深入研究培養(yǎng)條件對(duì)脫色率的影響；最后，綜合FTIR分析的結(jié)果，對(duì)脫色原理進(jìn)行了初步的分析。

1 材料方法

1.1 材料和培養(yǎng)基

菌種來(lái)源：一瓶長(zhǎng)滿菌苔的玫瑰紅廣告濃縮染料，其主要顯色原料成分為顏料紫1。顏料紫1結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。顏料紫1由吳江山湖化工有限公司免費(fèi)提供。

圖1 顏料紫1結(jié)構(gòu)圖

活化培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基。

利用平板和搖瓶培養(yǎng)分離菌種、斜面保藏菌種。單因素實(shí)驗(yàn)在察氏培養(yǎng)基中根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤氩煌瑵舛鹊念伭献?、NaNO3，加入相同含量的不同碳源，調(diào)節(jié)不同pH值條件，30℃培養(yǎng)10天。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面方案并分析結(jié)果，得出較佳培養(yǎng)條件。

1.2 顏料紫1含量測(cè)定方法

采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析的T6新世紀(jì)）對(duì)顏料紫1進(jìn)行吸收峰掃描，得出在557nm波長(zhǎng)下，顏料紫有最大吸收峰。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

發(fā)酵液經(jīng)4℃、14000r/min 離心10min，使得發(fā)酵液中的菌體沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移到試管中。將分離到的上清液再經(jīng)循環(huán)水式多用真空泵抽濾，進(jìn)一步去除上清液中可能殘留的菌體及較大顆粒性物質(zhì)。加入適量蒸餾水進(jìn)行稀釋，在557nm 波長(zhǎng)下用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)OD 值。以蒸餾水為空白組，分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組①、②、③和對(duì)照組的OD值A(chǔ)1、A2、A3、A0，代入顏料紫標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出對(duì)應(yīng)的脫色率X。脫色率計(jì)算公式如式（1）。

1.3 發(fā)酵前后顏料紫1的FTIR分析

發(fā)酵液14000r/min 離心10min；向上清液中加入等體積的乙酸乙酯，用無(wú)水NaSO4過(guò)夜干燥，過(guò)濾；取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，取出干燥物，烘干；向烘干物中以5∶95的比例加入KBr，混勻，壓成片；利用傅里葉變換紅外光譜儀（Spectrum BXII）（FTIR）測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 菌種培養(yǎng)與分子鑒定

自顏料中分離得到的菌經(jīng)培養(yǎng)、平板分離得到單菌落，經(jīng)鏡檢（圖2）初步判斷為曲霉。利用ITS4、ITS5作為上下游引物，對(duì)菌種18S rDNA擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物（圖3），條帶大小約為650 bp。經(jīng)由上海生工測(cè)序，結(jié)果如下。

圖2 未知菌的孢子圖

圖3 PCR產(chǎn)物電泳分析

TGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCG TAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGT GCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACC CGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGG AACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTA CTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTG AGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAA CAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAG AACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAAC GCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCA TGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAG CCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCC CGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCA CCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTG TCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCA GCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGA CCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT AAGCATATCAATAAGCGGAGGAA。通過(guò)提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行核酸比對(duì)，利用MEGA6.06軟件建立進(jìn)化樹(shù)（圖4），發(fā)現(xiàn)本研究所篩選出的菌株與雜色曲霉（Aspergillus versicolor）有高度的同源性。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

初步的研究-明：培養(yǎng)基顏色明顯變淺的最短時(shí)間為10天，故培養(yǎng)周期均為10天。染料超過(guò)一定范圍對(duì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用[15-16]，是影響脫色率的重要因素。本研究中用察氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，加入不同濃度的顏料紫1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。濃度在200mg/L處，最大脫色率為52.9%。碳源是影響菌體生長(zhǎng)的重要因素之一，本實(shí)驗(yàn)探討了4種碳源（圖6）。結(jié)果顯示：碳源為葡萄糖時(shí)，染料的脫色效率最高，達(dá)到41.59%。乳糖與蔗糖做碳源時(shí)脫色率接近，但較葡萄糖為碳源時(shí)低。用微晶纖維素做碳源時(shí)，脫色率為0，說(shuō)明此菌不能降解纖維素發(fā)酵。

NaNO3屬于中性鹽，可以改變培養(yǎng)基的滲透壓，改變細(xì)胞膜滲透性，影響菌體生長(zhǎng)。該真菌的生長(zhǎng)不需要太高濃度的NaNO3，氮源濃度低至NaNO30.5g/L時(shí)，脫色效率反而較高（圖7）。

染料的脫色率與pH值也是密切相關(guān)的，pH值較低時(shí)（低于5.0），染料的脫色率較差（圖8），而在pH=5.5時(shí)，能夠取得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。pH值不僅對(duì)染料被脫色降解的速率有很大的影響，宏觀上還對(duì)菌絲球的形態(tài)、結(jié)構(gòu)有很大的影響。在pH值低至4.50時(shí)，菌絲球結(jié)構(gòu)脆弱、不易成形，往往為松散的糊狀。pH值在5.50～6.00時(shí)，形態(tài)結(jié)構(gòu)緊致、呈飽滿的圓球狀。而高于6.50時(shí)，菌絲球又會(huì)發(fā)生膨脹、甚至出現(xiàn)松散。

圖4 進(jìn)化樹(shù)

圖5 顏料紫1濃度對(duì)脫色率的影響

圖6 碳源對(duì)脫色率的影響

圖7 NaNO3濃度對(duì)脫色率的影響

圖8 pH值對(duì)脫色率的影響

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，利用Design-expert設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）。表2直觀顯示顏料紫1濃度200mg/L、NaNO3濃度0.5g/L、pH 值5.5的組合最有利于真菌對(duì)染料的脫色，平均脫色率可達(dá)78.03%。根據(jù)Box-Behnken的設(shè)計(jì)原理，擬合出二次回歸方程為式（2）。

表1 響應(yīng)面結(jié)果分析

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

式中，A、B、C均是3個(gè)因素的編碼值，范圍在-1～1。決定系數(shù)為R2=0.9176，回歸模型的P值為0.0048＜0.01，失擬P值=0.3851＞0.1，說(shuō)明模型回歸極其顯著，失擬不顯著，因此可用于Aspergillus versicolor對(duì)顏料紫1脫色的理論預(yù)測(cè)，無(wú)需引入更高次項(xiàng)。其中AC、B2、C2影響顯著，說(shuō)明顏料紫1和NaNO3之間的相互作用影響脫色率。NaNO3濃度和pH值與脫色率間不是呈直線關(guān)系，而呈曲線關(guān)系。響應(yīng)面分析圖見(jiàn)圖9。pH值5.5時(shí)，NaNO3濃度在0～0.8g/L范圍內(nèi)、顏料濃度＞160mg/L時(shí)，可以獲得最高的脫色率；NaNO3濃度確定為0.5g/L時(shí)，最高脫色率的染料濃度范圍為160mg/L以上，pH值范圍為5.3～5.7；染料濃度確定為200mg/L時(shí)，NaNO3濃度在0.1～0.8g/L范圍內(nèi)、pH值5.3～5.7范圍內(nèi)效果最佳，取得最大脫色率。綜合分析三因素的最佳范圍為：顏料紫1濃度＞160mg/L，0.8g/L＞NaNO3濃度＞0.1g/L，5.7＞pH值＞5.3。利用Box-Behnken中的Optimization優(yōu)化得到的較優(yōu)值為顏料紫1濃度為250mg/L，NaNO3濃度為0.3g/L，pH值 5.5，脫色率可達(dá)到84.64%。此方案及預(yù)測(cè)值與響應(yīng)面方案中第17個(gè)實(shí)驗(yàn)和結(jié)果接近。

2.4 FTIR測(cè)定結(jié)果

圖9 響應(yīng)面分析圖

圖10 發(fā)酵前后顏料紫1的FTIR分析圖

利用FTIR分析發(fā)酵前后顏料紫1結(jié)構(gòu)的變化，頻率在400～4000cm-1，研究結(jié)果見(jiàn)圖10，除了因?yàn)闄z測(cè)時(shí)壓餅的量不同導(dǎo)致發(fā)酵后的吸光值較高外，總體而言發(fā)酵前后峰形基本沒(méi)很大區(qū)別。箭頭所示區(qū)域約頻率為1700cm-1處是—C=O—基團(tuán)吸收區(qū)，發(fā)酵后的吸收值較大，這與發(fā)酵后顏料紫1結(jié)構(gòu)中—OH上的—H（見(jiàn)圖8）發(fā)生移動(dòng)有關(guān)。頻率在1000～1400cm-1處是=CH—O—CH=的指紋圖區(qū)域，發(fā)酵前后沒(méi)什么變化，說(shuō)明=CH—O—CH=沒(méi)有被破壞。由此可以判斷顏料紫1的結(jié)構(gòu)基本沒(méi)有發(fā)生大的變化，發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生脫色現(xiàn)象的原因應(yīng)該只是菌體對(duì)它的吸附。這也進(jìn)一步解釋了為何影響脫色的因素與菌體生長(zhǎng)量有一定的正相關(guān)。

3 分析討論

雜色曲霉（Aspergillus versicolor）又稱為花斑曲霉，目前Aspergillus versicolor因?yàn)槠洚a(chǎn)生了相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞毒性化合物以及其他的生物活性化合物而受到人們的廣泛關(guān)注[17-20]。也有利用雜色曲霉吸附金屬元素，如吸附鉛[21]，吸附Cr(Ⅵ)、Ni(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)等[22]，減少金屬釋放到水中，降低水污染；有的研究了Aspergillus versicolor對(duì)有機(jī)物的降解，如用Aspergillus versicolor生物降解共聚物丁二酸/己二酸-丁二醇酯（PBSA）薄膜[23]，效果很好；由Aspergillus versicolor解毒和消除雌激素4-壬基酚[24]。Aspergillus versicolor也被用于脫色，如對(duì)雷馬素藍(lán)活性染料（Remazol Blue Reactive textile dye）[22，25]的吸附脫色，但對(duì)脫色的原因沒(méi)有具體分析。本研究首次深入分析了Aspergillus versicolor對(duì)顏料紫1的脫色，并且利用FTIR比較了發(fā)酵前后顏料紫1結(jié)構(gòu)的變化，研究結(jié)果表明了該菌對(duì)顏料紫1的脫色機(jī)制主要是吸附脫色。生物吸附脫色的機(jī)理有很多[26]，包括物理化學(xué)吸附、離子交換、配位絡(luò)合、螯合、靜電作用、微量沉淀等。本研究中通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化分析，得出鹽離子濃度和pH值的變化都會(huì)導(dǎo)致脫色率的不同。究其原因，一方面是菌體量發(fā)生變化；另一方面菌體表面結(jié)構(gòu)、電荷以及顏料結(jié)構(gòu)都會(huì)發(fā)生變化，所以離子交換、氫鍵的建立等都會(huì)導(dǎo)致吸附量不同，改變脫色率。

4 結(jié) 論

對(duì)一株從污染的廣告顏料中分離的菌進(jìn)行了篩選、鏡檢分析和分子鑒定。確定了該菌為雜色曲霉（Aspergillus versicolor）。首次對(duì)采用該菌對(duì)顏料紫1的脫色進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，其中脫色的主要機(jī)制經(jīng)過(guò)紅外光譜分析確定為吸附脫色。此外，通過(guò)研究分析發(fā)現(xiàn)適合該菌生長(zhǎng)的碳源為葡萄糖，綜合單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化研究得出脫色實(shí)驗(yàn)過(guò)程N(yùn)aNO3濃度在0.3g/L、pH值在5.5、顏料紫1的濃度約為250mg/L為最佳條件。對(duì)于吸附脫色的動(dòng)力學(xué)研究與吸附脫色原理還有待進(jìn)一步分析。

[1] Sharma P ，Kaur H ，Sharma M ，et al. A review on applicability of naturally available adsorbents for the removal of hazardous dyes from aqueous waste[J].Environ. Monit. Assess.，2011，183：151-195.

[2] Chowdhury S，Chakraborty S，Saha P D. Response surface optimization of a dynamic dye adsorption process：A case study of crystal violet adsorption onto NaOH-modified rice husk[J].Environ. Sci. Pollut. Res.，2013，20（3）：1698-1705.

[3] Sun D，Zhang X ，Wu Y ，et al. Kinetic mechanism of competitive adsorption of disperse dye and anionic dye on fly ash[J].Int. J. Environ. Sci. Technol.，2013，10（4）：799-808.

[4] Yuan Y L，Wen Y Z，Li X Y，et al. Treatment of wastewater from dye manufacturing industry by coagulation[J].J. Zhejiang Univ. Sci. A，2006，7（S2）：340-344.

[5] Parsa J B，Chianeh F N. Evaluation of electro-coagulation method for decolorization and degradation of organic dyes in aqueous solutions[J].Korean J. Chem. Eng.，2012，29（11）：1585-1590.

[6] Bhowon M G，Laulloo S J，Wah H L K，et al. Chemistry Education in the ICT Age[M]. America：Springer Netherlands，2009：225-234.

[7] Vinodgopal K，Peller J. Hydroxyl radical-mediated advanced oxidation processes for textile dyes：A comparison of the radiolytic and sonolytic degradation of the monoazo dye Acid Orange 7[J].Res. Chem. Intermed.，2003，29（3）：307-316.

[8] 劉新穎，朱啟忠，趙春媛，等. 雙孢菇漆酶酶學(xué)性質(zhì)及染料脫色初探[J]. 食用菌，2010（14）：182-183.

[9] Kapdan I ，Kargi F，Mcmullan G，et al. Comparison of white-rot fungi cultures for decolorization of textile dyestuffs[J].Bioprocess. Eng.，2000，22（4）：347-351.

[10] Prasad A S A ，Rao K V B. Aerobic biodegradation of Azo dye byBacillus cohniiMTCC 3616;an obligately alkaliphilic bacterium and toxicity evaluation of metabolites by different bioassay systems[J].Appl. Microbiol. Biotechnol.，2013，97（16）：7469-7481.

[11] Vijayalakshmidevi S R，Muthukumar K. Biodegradation of malachite green byOchrobactrumsp.[J].World J. Microbiol. Biotechnol.，2014，30（2）：429-437.

[12] 李慧，曲媛媛，時(shí)勝男，等. 一株高效廣譜染料降解細(xì)菌的分離鑒定及其脫色特性初探[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（4）：523-530.

[13] Bhawana P，F(xiàn)ulekar M H. Bioremediation of dyestuff compounds using indigenous microorganism in a bioreactor[J].Procedia APCBEE，2012，1（1）：27-33.

[14] Dellai A，Dridi D，Lemorvan V，et al. Decolorization does not always mean detoxification：Case study of a newly isolatedPseudomonas pelifor decolorization of textile wastewater[J].Environ. Sci. Pollut. Res.，2013，20（8）：5790-5796.

[15] 張朝暉，夏黎明，林建平，等. 黃孢原毛平革菌所產(chǎn)木素過(guò)氧化物酶系對(duì)染料降解的研究[J]. 環(huán)境污染與防治，2002，24（2）：71-76.

[16] 李慧蓉，陳武，陳和謙. 黃孢原毛平革菌對(duì)三苯甲烷染料的生物脫色降解[J]. 上海環(huán)境科學(xué)，2003，22（11）：738-742.

[17] Belofsky G N，Renner M K，F(xiàn)enical W，et al. New cytotoxic sesquiterpenoid nitrobenzoyl esters from a marine isolate of the fungusAspergillus versicolor[J].Tetrahedron，1998，54（9）：1715-1724.

[18] Lee Y M，Li H Y，Hong J，et al. Bioactive metabolites from the sponge-derived fungusAspergillus versicolor[J].Arch. Pharm. Res.，2010，33（2）：231-235.

[19] Chung D H，Abouzied M M，Pestka J J. Immunochemical assay applied to mycotoxin biosynthesis：ELISA comparison of sterigmatocystin production byAspergillus versicolorandAspergillus nidulans[J].Mycopathologia，1989，107（2-3）：93-100.

[20] Carvalho M R，Barbosa L C A，Queiróz J H，et al. Novel lactones fromAspergillus versicolor; production of sterigmatocystin byAspergillus versicolorQM 432 used in fungus resistance tests for United States military specifications[J].Tetrahedron Lett.，2001，42（5）：809-811.

[21] Bairagia H，Khan M M R，Ray L，et al. Adsorption profile of lead onAspergillus versicolor：A mechanistic probing[J].J. Hazard. Mater.，2011，186（1）：756-764.

[22] Tastan B E，Ertu?rul S，D?nmez G. Effective bioremoval of reactive dye and heavy metals byAspergillus versicolor[J].Bioresour. Technol.，2010，101（3）：870-876.

[23] Zhao J H，Wang X Q，Zeng J，et al. Biodegradation of poly(butylene succinate-co-butylene adipate) byAspergillus versicolor[J].Polym. Degrad. and Stabil.，2005，90（1）：173-179.

[24] Krupiński M，Szewczyk R，Dlugoński J. Detoxification and elimination of xenoestrogen nonylphenol by the filamentous fungusAspergillus versicolor[J].Int. Biodeterior. and Biodegrad.，2013，82：59-66.

[25] Gül ü D，D?nmez G. Effects of dodecyl trimethyl ammonium bromide surfactant on decolorization remazol blue by a livingAspergillus versicolorstrain[J].J. Surfactants Deterg.，2012，15（6）：797-803.

[26] Asgher M. Biosorption of reactive dyes：A review[J].Water Air Soil Pollut.，2012，223（5）：2417-2435.