紅豆杉單組分多糖的超濾預處理及連續(xù)分離工藝

張菲菲，田慧，梁亞非，吳綿斌，林建平，楊立榮

（1浙江大學生物質(zhì)化工教育部重點實驗室，浙江 杭州 310027；2浙江大學化學工程與生物工程學系，浙江 杭州 310027；3金華市人民醫(yī)院，浙江 金華 318100）

紅豆杉為世界瀕危珍稀植物，素有“植物黃金”之稱[1]，是國家一級保護珍貴樹種。20世紀60年代后，人們逐漸發(fā)現(xiàn)植物多糖在抗腫瘤、抗病毒、抗心血管疾病、抗衰老等方面有著獨特的生物活性，且已發(fā)現(xiàn)有100多種中藥植物中的多糖類具有免疫促進作用。這類多糖沒有細胞毒性而且藥物質(zhì)量通過化學手段容易控制，已經(jīng)成為當今新藥開發(fā)的主流方向之一[2]。隨著對植物多糖活性的認識不斷加深[3-4]，近年開始重視紅豆杉提取物的綜合利用問題，紅豆杉浸膏中的水溶性成分含有帶支鏈的多糖類物質(zhì)[5-8]，紅豆杉多糖具有增強免疫、清除自由基、防止心肌梗死、抗腫瘤等作用[6]。

本工作采用水提醇沉后得到的紅豆杉粗多糖為原料，采用超濾的方法對多糖進行預處理，并研究最佳的超濾預處理條件[7]，并在此條件下進一步采用自主設計的連續(xù)分離設備[9-10]，實現(xiàn)了紅豆杉酸性單組分多糖PST-1的中試規(guī)模連續(xù)分離[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆杉粗多糖由本實驗室自制；Millipore Pellicon XL Biomax 5,10,50（美國Millipore公司）；微濾膜；DEAE-Sepharose FF （Pharmacia公司）；Millipore TFT 切向流超濾裝置（美國Millipore公司）；UNICO UV/VIS 2802PC分光光度計（美國尤尼克）；連續(xù)分離設備（自制）；BMH RLP HR 1-2LD冷凍干燥機（德國博勱行）；TDL-5000B 冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；pH/電導儀（德國Sartorius公司）；中壓柱（上海華美儀器廠）。

1.2 測定方法

多糖含量和純度的測定分別采用苯酚-硫酸法[11]和高效液相色譜法（HPLC）[12]。

HPLC具體操作條件：Aminex?HPX-87C色譜柱，流動相為純水，流速為0.4mL/min柱溫為76℃，電噴霧檢測器檢測。膜截留率R計算見式（1），脫色率F的計算見式（2）。

式（1）中，OD1和OD0分別為透過液和料液在485nm下的吸光度濃度。

式（2）中，OD1和OD0分別是透過液和料液在315nm下的吸光度濃度; 提取液脫色率測定采用紫外可見光分光光度法，以蒸餾水作空白對照進行測定。膜通量的計算如式（3）。

式中，J為膜通量，L/(m2·h)；V為透過液體積，L；A為膜的有效面積，m2；T為操作時間，h。

1.3 實驗方法

1.3.1 超濾試驗

控制超濾壓力20psi（1psi=6894.76kPa），溫度25℃，通過5kDa、10kDa、50kDa三種膜進行超濾，將200mL、濃度5g/L的紅豆杉多糖溶液超濾至25mL?？疾炷ね?、脫色率、截留率以及膜的恢復率，確定脫除紅豆杉多糖種色素的最佳膜類別。并從多糖濃度、pH值、溫度、操作壓力及超濾處理量方面對超濾工藝進行優(yōu)化。為了減輕紅豆杉多糖溶液中雜質(zhì)對超濾膜的污染，料液在通過膜組件之前順序采用離心分離和微濾進行預處理。其中離心機轉(zhuǎn)速4000r/min，離心時間30min，微濾選擇0.45μm的濾膜進行操作[13-14]。

1.3.2 DEAE-Sepharose FF 離子交換凝膠柱灌裝及處理

先在柱子中加入1/3的去離子水，灌膠，同時打開下端出口，以使凝膠迅速沉淀；用1mol/L NaOH 500mL以218cm/h的速度沖洗柱床；用去離子水洗至中性，用1mol/L HCl 500mL以218cm/h的速度沖洗柱床；用去離子水洗至中性，再用Tris-HCl緩沖液沖洗即可。

1.3.3 連續(xù)色譜分離工藝：

系統(tǒng)如圖1所示，由24個電磁閥（K、D、M、A、B）、4個泵（P1、P2、P3、P4）、4個DEAE-Sepharose FF離子交換柱（1、2、3、4，φ5cm×90cm）組成，其中通過P1、P3、P4的3根管道圖中只畫出一根代替。通過可編程控制器（PLC）可以對該系統(tǒng)進行手動、自動控制。將超濾處理過的紅豆杉多糖溶液連通K2通路，Tris-HCl連通K1－1通路，0.1mol/L NaCl的Tris-HCl 連通K1－2通路，0.3mol/L NaCl的Tris-HCl 連通K1－3通路。調(diào)解連續(xù)離子交換設備 動力泵，線速度調(diào)節(jié)至218cm/h，原料處理速度為4.17L/h，處理量100.08L/d，一個周期內(nèi)各離子交換柱所在區(qū)域以及操作時不同操作區(qū)見表1和表2。

開啟連續(xù)離子交換設備，一天進行8個周期，每個周期處理多糖溶液12.51L，目標多糖PST-1收集于K3－3。

圖1 連續(xù)色譜分離工藝流程示意圖

表1 操作分區(qū)及運行周期一覽表

表2 一周期內(nèi)各柱所在區(qū)

1.3.4 超濾除鹽

選用截流相對分子質(zhì)量為50kDa的超濾膜脫除鹽和小分子，純化連續(xù)離子交換色譜分離的酸性多糖PST-1，使其純度達到99%以上。

2 結(jié)果與討論

2.1 超濾試驗

2.1.1 超濾脫色除雜試驗

通過圖2和表3可以發(fā)現(xiàn)，隨著超濾膜截留相對分子質(zhì)量的增加，膜通量上升很快，而截留率和脫色率明顯下降；同時參照表4，不同截留相對分子質(zhì)量膜通量的恢復情況，5kDa膜恢復最好。綜合以上幾個因素，選擇以5kDa膜作為分離紅豆杉多糖的適宜膜孔徑分離參數(shù)比較合適。

2.1.2 5kDa 膜超濾工藝優(yōu)化

在上述試驗的基礎上，從多糖濃度、pH值、溫 度、操作壓力及超濾處理量方面對5kDA膜進行工藝優(yōu)化試驗。 選擇紅豆杉多糖溶液的濃度分別為5g/L、10 g/L、15 g/L，結(jié)果如圖3(a)、圖4(a)所示。隨著濃度的增加，多糖截留率明顯增加，但與此同時脫色率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，膜通量隨著紅豆杉多糖濃度的增加下降很快，從5g/L的22.3%下降到15g/L的17.6%。綜合這3個因素，選擇10g/L作為超濾的最佳濃度。選擇紅豆杉多糖溶液的pH值分別為5.0、6.8（原糖液）、8.5，結(jié)果如圖3(b)、圖4(b)所示，在3個pH值處，截留率、脫色率及膜通量沒有很大的變化，因而選擇6.8（原糖液）作為超濾的pH值。選擇溫度分別在25℃、35℃、45℃，結(jié)果如圖3(c)、圖4(c)所示，隨著超濾溫度的增加，糖液的黏度下降，擴散系數(shù)和傳質(zhì)系數(shù)以及多糖的 溶解度均增大，相應會減弱濃差極化，從而導致膜通量增大[15]；但溫度升高，會影響膜的截留性能，造成截留率明顯下降，此外，在高溫下，多糖可能發(fā)生不同程度的分解。考慮膜的性能及料液性能的穩(wěn)定性，實驗采用25℃進行超濾。通過調(diào)整泵和回流閥來控制超濾的壓力分別為20psi、30psi，結(jié)果 如圖3(d)、圖4(d)所示，隨著超濾壓力的增加，膜通量和脫色率有所增加，但增加幅度不是很大，而且隨著膜通量的增加紅豆杉多糖的截留率會相應降低；同時隨著超濾時間的延長，二者的膜通量和逐漸接近，這符合超濾過程中的濃差極化和凝膠層理論。因此不能單純依靠提高超濾壓力來提高加快膜超濾速度，實際操作時選用20psi。將200mL 10g/L的紅豆杉多糖溶液超濾至25mL，再添加去離子水至200mL，反復超濾8次，實驗結(jié)果如圖3(e)、圖4(e)所示，隨著超濾次數(shù)的增加，膜通量線先下降再上升，總體變化不是很明顯，這可能是由于超濾過程中多糖損失引起的；同時脫色率也呈明顯上升的趨勢，但超濾處次數(shù)超過4次時，上升不是很明顯，而截留率明顯下降。因而選擇超濾4次為最佳的處理次數(shù)。

表3 不同超濾膜的多糖保留率和脫色率

圖2 不同截留率膜的通量變化情況

表4 不同截留分子量膜通量恢復情況

圖3 不同操作條件對截留率和脫色率的影響

圖4 不同操作條件對膜通量的影響

此次確定的最佳超濾優(yōu)化條件，可作為后續(xù)連續(xù)色譜分離的預處理條件，從而實現(xiàn)更好的分離 效果。

2.2 連續(xù)色譜工藝分離酸性單多糖PST-1試驗

按照1.3.3節(jié)的連續(xù)分離工藝，對超濾預處理后得到的紅豆杉單組分多糖進行了24h、48h和72h的連續(xù)分離試驗，試驗結(jié)果見表5。由表5結(jié)果可知，采用自制的連續(xù)分離設備，每天上樣均可以達到100.08L，并且在經(jīng)HPLC測定PST-1純度平均達到99.0%以上，收率可以達到50.0%以上；而且連續(xù)24h和連續(xù)48h、72h所得到的PST-1的純度和收率數(shù)據(jù)基本保持一致，說明自制的連續(xù)分離設備能夠?qū)崿F(xiàn)多糖的穩(wěn)定分離。

其中在72h連續(xù)操作中，離子交換色譜共進行了24個批次的上柱、洗脫和再生的操作過程，試驗結(jié)果見表6。從表6可知，PST-1的平均純度均在99.0% （質(zhì)量比）以上，收率也均在50.0%以上， 純度和收率數(shù)據(jù)基本保持不變，說明多糖分離過程穩(wěn)定，因此基本達到了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。

表5 不同時間連續(xù)試驗結(jié)果一覽表

表6 連續(xù)72h操作中不同批次多糖產(chǎn)品一覽表

3 結(jié) 論

為了實現(xiàn)連續(xù)色譜分離紅豆杉單組分多糖，采用了超濾法對粗多糖進行脫色預處理，超濾優(yōu)化條件：截留相對分子質(zhì)量為5kDa，溫度為25℃，壓力為20psi，pH值為6.8，將1L的濃度為10g/L的紅豆杉多糖溶液超濾至125mL，再添加去離子水至1L，反復超濾4次，紅豆杉多糖的截留率和脫色率分別達到了87.2%和75.6%。在此最佳預處理條件下，采用自制的連續(xù)設備從脫色后的多糖中連續(xù)分離酸性單多糖，每天處理量為100.08L，PST-1平均HPLC純度可以達到99.0%以上，收率高于50.0%。在實驗中進行了連續(xù)72h的分離試驗，共進行了24個周期的上樣、洗脫和再生的過程，每個周期時間為180min，PST-1平均純度均在99.0%以上，收率高于50.0%，而且數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定，基本達到了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。相對于間歇色譜分離過程，本研究自制的連續(xù)色譜分離設備在高純度和高收率的情況下，能夠節(jié)省時間和人力，因而對一些大分子物質(zhì)的分離具有一定的借鑒意義。

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