血紅蛋白在殼聚糖/納米金/APS/普魯士藍復(fù)合膜修飾電極上的直接電化學(xué)

□單彩霞 □趙飛燕

（1濮陽水文水資源勘測局 2安陽水文水資源勘測局）

0 引言

本法基于Hb-Chit/AuNPs/APS/PB多層膜修飾的玻碳電極為工作電極，研究了其制作、表征及對該修飾電極多層膜為基礎(chǔ)的生物傳感器的性能分析。通過電沉積的方法將PB修飾到GCE電極表面，制得PB/GCE電極；將帶正電荷、含有大量氨基的3-氨丙基三乙烯硅烷(APS)修飾到電極表面，并通過相反電荷之間的靜電相互作用將含有大量負電荷的納米金(AuNPs)固附于電極表面形成復(fù)合膜，最后，將Hb和殼聚糖溶液固載于多層膜修飾的電極上。由于PB特殊的催化特性，AuNPs和Hb分子的協(xié)同影響，這種生物傳感器具有良好的性能，即具有高的靈敏度、較強的穩(wěn)定性和選擇性、響應(yīng)時間短、線性范圍寬的優(yōu)點，這種新型的修飾方法為研究蛋白質(zhì)電化學(xué)提供了有效的功能界面，成功地用于測定H2O2。

1 實驗部分

1.1 傳感器的構(gòu)制

玻碳電極依次用1.00，0.50，0.05μm的Al2O3漿在麓皮紙上拋光成鏡面以去除表面吸附有機物，每次拋光后先洗去表面污物，再用去離子水超聲清洗，重復(fù)三次，最后依次用HNO3溶液(1:1)，乙醇溶液(1:1)，去離子水超聲清洗(每次3-5min),將清洗好的電極晾干待用。

將含有2mmol/LFeCl3+2mmol/LK3[Fe(CN)6]+0.10mol/LKCl+0.10mol/LHCl的溶液通氬氣除氧10min，在氬氣氛圍內(nèi)，將處理好的裸GCE置于此溶液中，以恒電壓+0.4 V進行電化學(xué)聚合120 s，即得到PB/GCE修飾電極。經(jīng)過條件優(yōu)化，將PB/GCE修飾電極置于含0.10mol/LKCl和0.10mol/LHCl的電解液中，并以50mV/s的掃描速率在-0.05V～+0.35 V范圍內(nèi)掃描20圈，隨著聚合圈數(shù)增加，PB/GCE上的聚合峰電流逐漸增大，到一定程度時不再變化(見圖1)，這表明電極表面形成了導(dǎo)電膜。由此產(chǎn)生的PB薄膜修飾電極用清水洗凈，并在氮氣氛圍下干燥。

圖1 PB修飾電極的循環(huán)伏安圖

用以上方法修飾電極處理后，將修飾電極浸泡在2%的APS溶液中30min，以促使電極表面引入大量的氨基基團。然后，該修飾電極用二次水徹底沖洗并在4℃條件下在納米金溶液中浸泡10 h。為得到Hb-Chit復(fù)合膜的最佳響應(yīng)，對Hb和Chit混合溶液修飾體積進行了優(yōu)化。將Hb和Chit混合溶液滴涂到修飾電極表面，在電極上方罩上小燒杯，后將該修飾薄膜在空氣中干燥過夜，以便形成均勻的復(fù)合膜。

2 Hb-Chit/AuNPs/APS/PB復(fù)合膜的光譜表征

2.1 紫外可見吸收光譜表征

圖2 Hb(a)，Hb-Chit/AuNPs/APS/PB修飾膜(b)的UV-vis光譜圖

圖2顯示了Hb(見圖2a曲線)及Hb在復(fù)合膜中(見圖2b曲線)的紫外可見光譜圖，對于包埋于Chit/AuNPs/APS/PB復(fù)合膜內(nèi)的Hb，在413 nm處出現(xiàn)了明顯的Soret吸收帶，僅比Hb Soret吸收帶紅移了4 nm。Soret吸收帶輕微的移動及吸收率減小歸結(jié)于復(fù)合膜與蛋白質(zhì)的交互作用，這種作用既不會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，也不會破壞生物分子基本的微水環(huán)境。在Chit/AuNPs/APS/PB復(fù)合膜(見圖2b曲線)中大約在535 nm處出現(xiàn)了一個相對突出的吸收峰，而在Hb中(見圖2a曲線)卻未曾出現(xiàn)此類吸收峰，主要是納米金的特征吸收峰峰值大概在535 nm附近。

2.2 紅外光譜表征

圖3 Hb(a)，Hb-Chit/AuNPs/APS/PB修飾膜(b)的紅外譜圖

Hb-Chit/AuNPs/APS/PB復(fù)合膜紅外光譜圖顯示了其組成部分的組合形狀(見圖3b曲線)，可以看出復(fù)合膜中的酰胺I和酰胺II基團與天然Hb的酰胺I和酰胺II基團結(jié)構(gòu)非常相似，說明在復(fù)合膜中，Hb的主要部分基本上保留了其天然結(jié)構(gòu)，構(gòu)象沒有發(fā)生大的變化。

3 修飾電極的直接電化學(xué)

3.1 循環(huán)伏安法測不同修飾電極的直接電化學(xué)行為

圖4 不同修飾電極的循環(huán)伏安圖

圖4顯示了在0.10mol/L pH7.00PBS中，在掃速100mV/s條件下，不同修飾電極的循環(huán)伏安行為。Hb-Chit/AuNPS/APS/PB/GCE電極得到了一對穩(wěn)定而明確的氧化還原峰(見圖4e曲線)，陽極峰電位(Epa)和陰極峰電位(Epc)分別位于160mV和250mV，式電勢Eo’=(Epa+Epc)/2=205mV。然而，在修飾膜中沒有Hb存在的條件下，只有PB/GCE電極得到一對可逆的氧化還原峰（見圖4b曲線），陽極峰電位和陰極峰電位分別位于210mV和276mV，式電勢為243mV，裸電極沒有任何氧化還原峰出現(xiàn)(見圖4a曲線)，顯然，Hb-Chit/AuNPS/APS/PB/GCE電極反應(yīng)的原因在于固載于電極表面的Hb的電化學(xué)氧化還原中心。另一方面，Hb-chit/PB修飾電極也出現(xiàn)了一對氧化還原峰(見圖4c曲線)，然而，這對氧化還原峰較之Hb-Chit/AuNPS/APS/PB/GCE修飾電極出現(xiàn)的氧化還原峰小的多，AuNPS在Hb電極反應(yīng)動力學(xué)中產(chǎn)生了巨大影響，在蛋白質(zhì)與底層電極之間的電子轉(zhuǎn)移方面，AuNPS提供一個適宜的微環(huán)境。當不用PB修飾電極時，峰值電流范圍變得較為廣泛，波峰間隔值增大且峰電流較小(見圖4d曲線)，可能是PB的存在促進了Hb與電極之間的電子轉(zhuǎn)移。

文章所用復(fù)合膜材料的生物相容性為Hb提供了一個與Hb本體天然狀態(tài)環(huán)境相似的微環(huán)境，Hb所處的微環(huán)境對其電子傳遞有較大的影響，電子傳遞過程與Hb在電極表面的取向有關(guān)，由于復(fù)合膜材料所帶電荷屬性不同，可以調(diào)節(jié)Hb在電極表面的取向，使其朝著利于電子受體或供體的方向進行，極大地促進了血紅蛋白與電極間的電子轉(zhuǎn)移過程。

圖5 Hb-Chit/AuNPs/APS/PB修飾電極的峰電流與掃速的關(guān)系圖

3.2 Hb-Chit/AuNPs/APS/PB修飾電極電化學(xué)行為的影響因素

3.2.1 電極峰電流與掃速的關(guān)系

圖5研究了Hb-Chit/AuNPS/APS/PB/GCE電極峰電流與掃速的關(guān)系，掃速在20～350mV/s范圍內(nèi)，隨著掃速的增加，氧化還原峰電流也隨之增加，氧化還原峰電位分別略有移動(還原峰正移，氧化峰負移)，且式電勢變大，說明隨著掃速增加，電極電子轉(zhuǎn)移過程更加不可逆。在此掃速范圍內(nèi)，峰電流與掃速成正比，表明電極反應(yīng)受表面影響。在已選擇的掃速范圍內(nèi)，氧化還原峰電流值幾乎相等，說明在復(fù)合材料修飾膜中的電活性HbFe(Ⅲ)在陰極掃描過程中轉(zhuǎn)化為HbFe(Ⅱ)，而在陽極掃描過程中還原態(tài)的HbFe(II)又全部轉(zhuǎn)化為氧化態(tài)的HbFe(Ⅲ)。

當掃速在20～350mV/s范圍內(nèi)時，峰電流與掃速呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。氧化還原峰電流Ip和掃描速度υ的線性回歸方程為Ipa(μA)=1.87+3.83×10-2υ(mV/s)(R=9.95×10-1)和Ipc(μA)=-3.26-1.79×10-2υ(mV/s)(R=9.98×10-1)，所有這些結(jié)果與表面控制或單電子薄層電化學(xué)行為相符合。

3.2.2 溶液pH對生物傳感器電化學(xué)行為的影響

實驗研究了pH4.0-9.0范圍內(nèi)Hb-Chit/AuNPS/APS/PB/GCE修飾電極的循環(huán)伏安行為，結(jié)果表明，隨著pH的增加，陰極峰和陽極峰均發(fā)生負移。此外陽極峰電勢Epa、陰極峰電勢Epc及式電勢Eo’(Epa/2+Epc/2)均與pH值呈線性關(guān)系，直線斜率分別為-48.00mV/pH、-44.50mV/pH和-46m V/pH，接近于1質(zhì)子1電子可逆電極反應(yīng)的理論值-59.00mV/pH，表明Hb和電極之間的電子傳遞過程伴隨有1質(zhì)子的傳遞，質(zhì)子參與主要是中和電化學(xué)還原過程中界面上積累過剩電荷，從而使靠近亞鐵血紅素的基團發(fā)生質(zhì)子化作用，該過程可表示為：HbFe(III)+H++e-→HbHFe(II)。

陽極峰電勢Epa、陰極峰電勢Epc及式電勢Eo’(Epa/2+Epc/2)與pH值線性關(guān)系的直線斜率均與理論值59.00mV/pH有些偏離，可能是由于質(zhì)子化是一個復(fù)雜的過程，受Hb配位基團和周圍的血紅素氨基酸共同影響。此外，在pH值為7.00左右時，在修飾電極上Hb氧化還原峰電流最大，其原因主要是Hb在pH值為7.00的PBS緩沖溶液中保持了高度的活性，故選擇pH值為7.00作為最佳底液pH值。

4 Hb-chit/AuNPS/APS/PB/GCE電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

在pH7.00PBS中，于-0.10V-0.60V范圍內(nèi)，對Hb-chit/AuNPS/APS/PB/GCE電極連續(xù)循環(huán)伏安掃描時，峰值電流基本保持不變，連續(xù)掃描80圈，氧化還原峰電流減小4.80%。該電極在4℃保存20 d，進行循環(huán)伏安掃描時發(fā)現(xiàn)電流沒有明顯的變化，僅比初始氧化還原電流降低6%左右，由此可見此修飾電極有較好的穩(wěn)定性。比較8支不同的Hb-chit/AuNPS/APS/PB/GCE電極(制備方法相同)對10μmol/LH2O2的響應(yīng)電流值，考察電極的重現(xiàn)性，測得RSD為5.20%，表明電極具有良好重現(xiàn)性。

5 結(jié)論

文章成功制備了一種新型的chit/AuNPS/APS/PB復(fù)合材料，并將其用于Hb的直接電化學(xué)研究。這一復(fù)合膜有極好的生物適應(yīng)性和穩(wěn)定性，能在電極表面為Hb提供合適的仿生微環(huán)境，保持了膜中Hb的活性，極大地促進Hb與電極間的電子轉(zhuǎn)移。該修飾膜修飾電極制備簡單、便捷且有良好穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。制備的Hb-chit/AuNPS/APS/PB/GCE復(fù)合膜修飾玻碳電極對H2O2有明顯的電催化活性，催化電流與較寬濃度范圍內(nèi)的H2O2呈良好線性關(guān)系，且無需額外的電子介體，這將為電化學(xué)傳感和生物傳感提供一個優(yōu)良的平臺。