HPLC法同時測定冬蟲夏草中5種核苷類成分

陳克盼，趙安權(quán)，王倩倩，趙　月，賀英菊，鄧　黎

HPLC法同時測定冬蟲夏草中5種核苷類成分

陳克盼，趙安權(quán)，王倩倩，趙月，賀英菊，鄧黎

（四川大學華西藥學院，四川成都610041）

用高效液相色譜法同時測定冬蟲夏草中鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素5種核苷類成分的含量。采用色譜柱為AichromBond-AQ C18柱（250mm×4.6mm×5μm），以乙腈-水（7∶93）為流動相，流量為0.8mL/min，檢測波長254nm，柱溫30℃。鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素的質(zhì)量濃度分別在1.01～5.50μg/mL（r=0.999 5）、0.05～1.01μg/mL（r=0.9998）、0.20～1.98μg/mL（r=0.9995）、1.01～5.07μg/mL（r=0.9995）、0.10～1.03μg/mL（r=0.9996）的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為99.1%，97.8%，98.6%，100.4%，99.2%，RSD（n=5）分別為1.15%，2.34%，2.01%，1.75%，1.50%。該方法簡便快速、準確度高、重現(xiàn)性好，可用于同時測定冬蟲夏草中鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素5種核苷類成分。

冬蟲夏草；高效液相色譜；核苷類成分；定量分析

doi：10.11857/j.issn.1674-5124.2015.09.013

0　引言

麥角菌科真菌冬蟲夏草Cordyceps sinensis（BerK.） Sacc，寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體，有補肺益腎、止血化痰的功效［1］，主要產(chǎn)于四川、青海、云南、西藏等海拔在3000～4000m的高山草甸區(qū)?，F(xiàn)代藥理學研究表明，冬蟲夏草具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗糖尿病、抗衰老等生理活性［2-3］，其主要的生理活性物質(zhì)為核苷類、蟲草多糖、氨基酸、甘露醇、甾醇類等［4-5］。藥典中冬蟲夏草的質(zhì)量指標主要為腺苷［1］，本實驗以鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素5種物質(zhì)為指標［6］，旨在更為全面地評價冬蟲夏草中的核苷類成分，并為其他相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1　儀器與試藥

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SPD-10Avp型紫外可見光檢測器（日本島津公司）；CPA225D型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；B-220型恒溫水浴鍋（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）；TGL-16G型離心機（上海安亭科學儀器廠）；RO DI digital型超純水機（上海和泰儀器有限公司）；GM-0.33II型隔膜真空泵（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；SB3200型超聲清洗機（必能信超聲上海有限公司）。甲醇為分析純（廣東光華科技股份有限公司）；乙腈為色譜純（廣東光華科技股份有限公司）；水為超純水。標準品：鳥嘌呤（中國食品藥品研究檢定院，批號：140631-201205，純度：99.6%）；胸腺嘧啶（中國藥品生物制品檢定所，140708-200401，純度：99.5%）；腺嘌呤（中國食品藥品研究檢定院，批號：110886-201102，純度，99.4%）；腺苷（中國食品藥品研究檢定院，批號：110879-200202，純度：99.5%）；蟲草素（中國藥品生物制品檢定所，批號：58-200202，純度：99.7%）。冬蟲夏草樣品由成都通靈中藥飲片精選有限公司提供，鮮蟲草經(jīng)曬干或低溫烘干而得。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

供試品溶液：取冬蟲夏草樣品，折成小段，液氮研磨至粉末狀［6］，精取100mg轉(zhuǎn)入100m L圓底燒瓶，加入10mL 90%甲醇，于80℃水浴中加熱30min［1］，冷卻至室溫，以90%甲醇補充溶劑損失，轉(zhuǎn)入離心管以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，吸取上清液，以4.5μm微孔濾膜過濾，密封避光冷藏備用。

對照品溶液：取一定量的鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素標準品，以90%甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為6.62，41.66，14.16，27.37，12.98μg/mL的混合對照品溶液，超聲2min。另以上述方法配制5.50，4.00，3.00，2.50，2.00，1.50，1.01μg/mL鳥嘌呤溶液，1.01，0.81，0.61，0.40，0.20，0.10，0.05μg/mL的胸腺嘧啶溶液，1.98，1.58，1.39，1.19，0.99，0.59，0.20μg/mL的腺嘌呤溶液，5.07，4.56，3.55，3.04，2.54，1.52，1.01μg/mL的腺苷溶液，1.03，0.82，0.62，0.52，0.41， 0.21，0.10μg/mL的蟲草素溶液。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：AichromBond-AQC18柱（250mm×4.6mm ×5μm）；流動相：乙腈-水（7∶93）；流量：0.8mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。上述條件下，對照品、供試品的色譜圖見圖1。結(jié)果表明，此條件下鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均在8000以上，達到了定量分析的要求，故該方法可用于上述5種成分的含量測定。

2.3線性關(guān)系及檢出限考察

精密吸取2.1中系列對照品溶液10μL，按2.2的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。以2.2的色譜條件，當信噪比為3時進樣濃度即為各物質(zhì)的檢出限，結(jié)果如表1所示。

圖1　對照品和供試品色譜圖

表1　5種成分的回歸方程、線性系數(shù)、線性范圍以及檢出限

可以看出，鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素質(zhì)量濃度分別在1.01～5.50，0.05～1.01，0.20～1.98，1.01～5.07，0.10～1.03μg/m L的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，該方法可用于上述范圍的定量分析。

2.4精密度試驗

精密吸取2.1中的混合對照品溶液10μL按2.2的色譜條件進行測定，連續(xù)進樣5次，記錄峰面積，并計算RSD值。鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素峰面積的RSD分別為1.25%，1.70%，1.46%，1.85%，1.15%，表明該方法的精密度良好。

表2　重復性試驗結(jié)果

2.5重復性試驗

精密稱取100mg冬蟲夏草粉末5份，分別按2.1的方法制備成供試品溶液，以2.2的色譜條件進行測定，記錄鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素的峰面積，計算RSD值，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯觯摲椒ǖ闹貜托粤己?。

表3　穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于0，2，4，8，12，24h［7］時以2.2的色譜條件進行測定，記錄鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素的峰面積，計算RSD值，結(jié)果如表3所示?？梢钥闯觯┰嚻啡芤褐懈鞒煞衷?4h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7加樣回收試驗

精密稱取100mg已知量的冬蟲夏草粉末5份，分別加入2.1中的混合對照品溶液1，2，3，4，5mL，以90%甲醇稀釋至10mL，按2.1的方法制備成供試品溶液，以2.2的色譜條件進行測定，結(jié)果見表4?？梢钥闯?，該方法的準確度高，可用于上述5種核苷類成分的定量分析。

表4　加樣回收率試驗結(jié)果

2.8樣品含量測定

以2.1的方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μL，以2.2的色譜條件進行測定，以外標法計算，結(jié)果見表5。

表5　含量測定結(jié)果

結(jié)果顯示，5種核苷類成分含量的測定結(jié)果與以往研究［6，8］相當。藥典中規(guī)定冬蟲夏草中腺苷的含量不少于0.010%［1］，以此為質(zhì)量標準可判定實驗樣品為合格冬蟲夏草。

3　討論

不同的提取溶劑會影響冬蟲夏草中核苷類成分的提取率，并顯著影響其他干擾成分如蛋白質(zhì)、多糖等的提取。實驗過程中比較了不同比例的甲醇-水對核苷類成分、干擾成分提取率的影響，水溶性成分的提取率隨著甲醇比例的增加而下降，減少了對核苷類成分色譜行為的干擾，最終采用了藥典中90%甲醇作為提取溶劑［1］。本實驗在提取前對蟲草樣品進行了液氮研磨處理以破壞其細胞結(jié)構(gòu)而獲得更高提取率，因此可以減少提取時間從而減少對核苷類成分的破壞。

近年來，關(guān)于冬蟲夏草的研究越來越多地聚焦于包括腺苷、蟲草素在內(nèi)的核苷類成分，核苷類成分分析的新方法也越來越多。周偉平等［9］用甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫測定腺苷和尿苷的含量，宋江峰等［10］以HPLC-DAD法測定蟲草素的含量，ESI-MS在蟲草素的定量分析中也有應(yīng)用［11］，毛細管區(qū)帶電泳法也被用于核苷類成分的分析［12-13］。但HPLC-DAD、HPLC-MS對鳥嘌呤、胸腺嘧啶、蟲草素等成分響應(yīng)信號不強，且上述方法對儀器設(shè)備的要求較高。本實驗進行等度洗脫并采用UV檢測器，設(shè)備要求較低，254nm的波長下上述5種核苷類成分響應(yīng)信號良好。

藥典中以腺苷為質(zhì)量指標評價冬蟲夏草的質(zhì)量優(yōu)劣，本實驗輔以鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、蟲草素等核苷類指標，旨在更全面地評價冬蟲夏草。梁文卉等［6］以［磷酸鹽緩沖液（pH=6.5）-甲醇（17∶3）］-甲醇梯度洗脫系統(tǒng)分析上述5種成分，流動相復雜，梯度洗脫對設(shè)備要求較高。藥典中HPLC法測腺苷含量以磷酸鹽緩沖液（pH=6.5）-甲醇（85∶15）為流動相［1］，流動相較為復雜，且含有緩沖鹽，對色譜柱損耗較大。實驗過程中嘗試了甲醇-水的流動相，甲醇-水（15∶85）對胸腺嘧啶和腺嘌呤的分離效果差，且柱效較低；甲醇-水梯度洗脫系統(tǒng)基線不穩(wěn)，測量結(jié)果偏差較嚴重。乙腈-水（7∶93）為流動相時，對5種成分的分離效果良好，柱效高，理論塔板數(shù)均在8000以上。與梯度洗脫相比，基線穩(wěn)定，測定結(jié)果準確度高。同時，避免了緩沖鹽的使用，減少了對色譜柱的損耗。

4　結(jié)束語

本實驗以鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、腺苷、蟲草素為指標評價冬蟲夏草的質(zhì)量，較單一的腺苷指標更為全面，采用HPLC-UV法，以乙腈-水（7∶93）為流動相等度洗脫，對儀器設(shè)備要求低，方法經(jīng)濟、簡便、快速，17min即可完成5種核苷類成分的定量分析，可用于對冬蟲夏草中核苷類成分的評價。

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HPLC determ ination of nucleosides in Cordyceps sinensis

CHEN Kepan，ZHAO Anquan，WANG Qianqian，ZHAO Yue，HE Yingju，DENG Li
（School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

In order to simultaneously determine the accurate content of guanine，thymine，adenine，adenosine and cordycepin in Cordyceps sinenis by RP-HPLC method.An AichromBond-AQ C18 column（250mm×4.6mm×5μm）is used as the analytical column，and acetonitrile-water（7∶93）as the mobile phase，the flow rate is set as 0.8mL/min，the detection wavelength is 254nm and the column temperature is 30℃.The linear ranges of guanine，thymine，adenine，adenosine and cordycepin are 1.01～5.50μg/mL（r=0.999 5），0.05～1.01μg/mL（r=0.999 8），0.20～1.98μg/mL（r= 0.999 5），1.01～5.07μg/mL（r=0.999 5），0.10～1.03μg/mL（r=0.999 6），respectively.The mean recoveries of the five components are 99.1%，97.8%，98.6%，100.4%，99.2%，respectively.The RSD（n=5）is 1.15%，2.34%，2.01%，1.75%，1.50%，respectively.The method is simple，quick，accurate，reproducible，and can be used to determine the content of guanine，thymine，adenine，adenosine and cordycepin in Cordyceps sinenis at the same time.

Cordyceps sinensis；HPLC；nucleoside；determination

A

1674-5124（2015）09-0056-04

2015-01-08；

2015-03-10

陳克盼（1991-），男，湖北十堰市人，碩士研究生，專業(yè)方向為中西藥物新劑型與新制劑研究。