一種從富含次生代謝產(chǎn)物茶樹(shù)嫩葉中高效提取基因組DNA的方法

唐祥凱，譚和平，沈興中，李懷平，許　洋，管　馳

一種從富含次生代謝產(chǎn)物茶樹(shù)嫩葉中高效提取基因組DNA的方法

唐祥凱1，2，譚和平1，2，沈興中2，李懷平1，2，許洋1，2，管馳1，2

（1.茶葉標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610021；2.中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院，四川成都610021）

建立一種從富含次生代謝產(chǎn)物的茶樹(shù)嫩葉中高效提取基因組DNA的方法。提出使用冷凍研磨機(jī)來(lái)破碎細(xì)胞，在確保低溫環(huán)境保護(hù)下，快速、均勻地破碎茶樹(shù)細(xì)胞，解決細(xì)胞破碎后易氧化、褐變的關(guān)鍵難點(diǎn)；同時(shí)在提取液中加入β-巰基乙醇等抗氧化劑進(jìn)一步防止多酚類化合物的氧化；經(jīng)過(guò)多次純化有效去除多酚、多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；所提取的基因組DNA經(jīng)驗(yàn)證完整性好、純度高，完全能進(jìn)行酶切和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。此外，進(jìn)行系統(tǒng)性的方法學(xué)考察，結(jié)果表明該提取方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好。該研究為茶樹(shù)基因組DNA提取標(biāo)準(zhǔn)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

DNA提取；茶樹(shù)；方法論；穩(wěn)定性分析

doi：10.11857/j.issn.1674-5124.2015.09.011

0　引言

基因組DNA是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，如何高效提取完整、純凈的DNA是生物技術(shù)工作者一直關(guān)注的問(wèn)題［1］。茶樹(shù)富含多酚、多糖、單寧等次生代謝產(chǎn)物［2-5］，茶葉細(xì)胞破碎后，多酚類化合物極易發(fā)生氧化、褐變，并與基因組DNA粘附在一起［6］，使得從茶樹(shù)中提取完整性好、純度高的基因組DNA變得異常困難，從而也極大制約了遺傳多樣性檢測(cè)、基因映射、圖位克隆、基因型鑒定等后續(xù)研究。

目前常規(guī)的基因組DNA提取方法，植物細(xì)胞的破碎一般采用手工研磨，耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，溫度和細(xì)胞破碎程度難控制；在研磨過(guò)程中極易發(fā)生多酚的氧化，提取的基因組DNA不完整，質(zhì)量穩(wěn)定性、重復(fù)性差。為了解決這些難題，本研究對(duì)現(xiàn)有的植物基因組提取方法進(jìn)行了改良和優(yōu)化，提出一種從富含次生代謝產(chǎn)物的茶樹(shù)嫩葉中高效提取基因組DNA的方法。

1　材料和方法

1.1植物材料

本研究選取國(guó)家級(jí)良種福鼎大白茶（Camellia sinensis cv.Fuding dabaicha）的一芽一葉為材料，材料均來(lái)自茶葉標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室盆栽場(chǎng)。

1.2儀器與試劑

6770冷凍研磨機(jī)（美國(guó)SPEX CertiPrep公司）；UV-1700分光光度計(jì)（日本SHIMADZU公司）；水凈化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；Veriti 96孔熱循環(huán)梯度PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；恒溫系統(tǒng)（美國(guó)JULABO公司）。

DNA提取液I：100mmol/L Tris-Cl，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5%SDS；DNA提取液II：18.6g葡萄糖，6.9g Na2S2O5，6.0g PVP，240μLβ-巰基乙醇，加水至300m L；乙酸鈉溶液：3mol/L，用乙酸調(diào)pH至5.2；氯仿∶異戊醇∶乙醇溶液（ν∶ν∶ν，80∶4∶16）；TE緩沖液：10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，使用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0；異丙醇；RNase A酶；無(wú)水乙醇；70%乙醇；EcoR I內(nèi)切酶；Pst I內(nèi)切酶；Taq DNA聚合酶；無(wú)菌雙蒸水。

1.3提取方法

1）取植物新鮮嫩葉，用無(wú)菌超純水沖洗1min，70%乙醇消毒2min，再用無(wú)菌超純水沖洗2min，最后用無(wú)菌吸水紙吸干水分，稱取約0.5 g備用（精確至0.1mg）。

2）將干凈樣品放于滅菌的樣品研磨瓶中，按表1程序?qū)悠费心コ煞蹱睿杆儆脽o(wú)菌玻棒將磨碎樣品轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的含有5mL DNA提取液II 的15mL離心管中，加入0.09 g Na2S2O5，0.2 g PVP，500μLβ-巰基乙醇，顛倒混勻，4℃5 000 r/min離心5min。

表1　研磨機(jī)研磨條件

3）去上清液，加入5mL預(yù)熱至65℃的DNA提取液I，溫和顛倒混勻，65℃溫浴1 h，溫浴期間每10min搖動(dòng)混勻一次。

4）將離心管放置于冰上冷卻，加入1m L預(yù)冷的NaAc溶液，混勻后加入5mL氯仿∶異戊醇∶乙醇溶液，溫和顛倒混勻（需帶手套，防止損傷皮膚），冰上靜置10min，使水相和有機(jī)相分層（必要時(shí)可重新混勻），4℃10000 r/min離心10min。

5）仔細(xì)移取上清液至一無(wú)菌15mL離心管中，如果在水相和有機(jī)相交界處有白色沉淀物，則重新抽提有機(jī)相，合并水相。

6）重復(fù)上述抽提步驟，向抽提得到的上清液中加入等體積異丙醇，溫和倒轉(zhuǎn)數(shù)次使之混勻，-20℃放置20min，出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。

7）將絮狀DNA沉淀轉(zhuǎn)入含600μL TE的無(wú)菌離心管中（如DNA不形成絮狀沉淀，則可在4℃10000 r/min離心5min，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60℃水浴放置15min以上，以幫助溶解）。

8）加入RNaseA溶液至RNase A終質(zhì)量濃度為10μg/mL，37℃溫浴30min；加入0.1g PVP，加入等體積氯仿∶異戊醇∶乙醇溶液，溫和顛倒混勻，并以10000 r/min離心10min。

9）取上清液于新的1.5mL滅菌離心管內(nèi)，重復(fù)抽提一次。

10）向抽提得到的上清液中加入1/10體積的NaAc溶液，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，-20℃放置20min左右。

11）4℃10 000 r/min離心10min，棄上清液，加入1 mL 70%乙醇，溫和顛倒離心管數(shù)次，洗滌沉淀。

12）重復(fù)11）步驟2次，向沉淀加入500μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇，4℃10000 r/min離心5～8s。

13）棄去乙醇溶液，將離心管開(kāi)蓋放置于室溫下，待乙醇揮發(fā)干后將DNA重新溶解于200μL TE緩沖液中。

1.4純度測(cè)試方法

1.4.1紫外光譜法

通過(guò)測(cè)定260nm/280nm吸光度比值來(lái)判斷所提取基因組DNA是否含有蛋白質(zhì)污染物；260 nm/ 230nm的吸光度比值來(lái)判斷基因組DNA是否含有鹽、碳水化合物等雜質(zhì)；260 nm/270 nm的吸光度比值來(lái)判斷基因組DNA是否含有多酚類雜質(zhì)［7］；DNA的濃度可以通過(guò)測(cè)定260nm處的吸光度值來(lái)?yè)Q算，但是測(cè)定前，應(yīng)將DNA溶液的濃度稀釋到260 nm處吸光度值介于0.1～0.5之間。

表2　基因組DNA樣品純度

1.4.2瓊脂糖凝膠電泳

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果來(lái)判斷所提取的基因組DNA的完整性和純度，取3μL DNA溶液在0.8%瓊脂糖凝膠上，以4V/cm的電壓電泳50min。

1.4.3限制性內(nèi)切核酸酶

通過(guò)限制性內(nèi)切酶反應(yīng)結(jié)果來(lái)判斷基因組DNA中是否含有限制性內(nèi)切酶的抑制劑，將500 ng基因組DNA和EcoR I酶混勻，在37℃水浴1h，將消化產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

1.4.4PCR

在反應(yīng)體系為50μL的離心管中加入300ng基因組DNA，5μL 10×PCR緩沖液，3μL 25mmol/L的氯化鎂，8μL 2.5 mmol/L的dNTP，2μL 10μmol/L的上引物，2μL 10μmol/L的下引物和1U 5 U/μL的Taq DNA聚合酶，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊至50μL，引物為5′-ATAAGCCAACTACAAGTCCAAGC-3′和5′-CACTATTCACCCAGTATTCCACC-3′。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃保持5min，1個(gè)循環(huán)；94℃保持30 s，53℃保持30 s，72℃保持30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃保持7min。擴(kuò)增結(jié)束后用凝膠純化試劑盒（天根，中國(guó)）純化PCR產(chǎn)物，并通過(guò)Pst I裂解，將PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，PCR產(chǎn)物的大小應(yīng)為364bp，產(chǎn)物DNA經(jīng)酶切后被分解為兩個(gè)片段，大小分別為76bp和288bp。

1.5方法學(xué)考察

穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)提取方法的一個(gè)主要因素，進(jìn)行6次重復(fù)性試驗(yàn)，提取的基因組DNA的純度通過(guò)紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1紫外光譜法

如表2所示，260 nm/280 nm吸光度比值介于1.81～1.83，這表明提取的基因組DNA中基本不含蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，260 nm/230 nm吸光度比值＞2.00，這表明基因組DNA中基本不含鹽、碳水化合物等雜質(zhì)，260nm/270nm吸光度比值為1.20，表明多酚類雜質(zhì)也被去除。

圖1　基因組DNA及酶切產(chǎn)物電泳圖

2.2瓊脂糖凝膠電泳

如圖1所示，DNA條帶集中在泳道中，在紫外燈照射下明亮且無(wú)拖尾現(xiàn)象，分子量約為23 kbp，能被EcoR I消化（圖1中泳道3和4），表明提取的基因組DNA完整，純度高，不含抑制限制性內(nèi)切酶的雜質(zhì)。

圖2　PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物電泳圖

2.3PCR

如圖2所示，以提取的基因組DNA樣品為模板，通過(guò)PCR可成功擴(kuò)增出364 bp的預(yù)期條帶，而PCR擴(kuò)增片段經(jīng)Pst I酶切后，可被成功酶切為76 bp和288bp的兩個(gè)片段，這表明所提取的基因組DNA樣品不含抑制PCR擴(kuò)增反應(yīng)的雜質(zhì)，可作為PCR反應(yīng)模板。

2.4重復(fù)性考察

如表3所示，經(jīng)過(guò)6次重復(fù)性試驗(yàn)，基因組DNA樣品的260nm/280 nm吸光度比值介于1.79～1.83，260nm/230nm吸光度比值均大于2.00，260nm/270nm吸光度比值介于1.20～1.22。如圖3所示，6個(gè)DNA樣本條帶集中在泳道中，在紫外燈照射下明亮且無(wú)拖尾現(xiàn)象，所提取基因組DNA不含蛋白質(zhì)、鹽、碳水化合物、多酚等雜質(zhì)，且純度基本一致，表明該基因組DNA提取方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性高。

表3　6個(gè)基因組DNA樣品的純度分析

圖3　6個(gè)基因組DNA樣品凝膠電泳圖

3　結(jié)束語(yǔ)

本研究建立了一種從富含次生代謝產(chǎn)物的茶樹(shù)嫩葉中高效提取基因組DNA的方法。在該方法中首次提出使用冷凍研磨機(jī)來(lái)破碎細(xì)胞，通常磨碎一個(gè)樣品只需1～2min；細(xì)胞的破碎時(shí)刻處于液氮環(huán)境保護(hù)下，同時(shí)在提取液中加入β-巰基乙醇等抗氧化劑［8-10］，可有效避免多酚類物質(zhì)的氧化；細(xì)胞破碎程度可根據(jù)需求進(jìn)行控制，使得每次提取的DNA完整性、質(zhì)量穩(wěn)定性和重復(fù)性都能得到有效保證。經(jīng)過(guò)多次純化去除多酚、多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，所提取的基因組DNA經(jīng)驗(yàn)證完整性好、純度高，完全能進(jìn)行酶切和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）；此外，系統(tǒng)性的方法學(xué)考察也表明該提取方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性高；本研究為茶樹(shù)基因組DNA提取標(biāo)準(zhǔn)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

研究還表明，適合茶樹(shù)基因組DNA提取的最佳材料為茶樹(shù)嫩葉，在提取過(guò)程中加入β-巰基乙醇、PVP、焦亞硫酸鈉等抗氧化劑對(duì)于防止多酚類物質(zhì)的氧化效果明顯，但β-巰基乙醇有刺激性氣味且有毒，操作過(guò)程中需謹(jǐn)慎；而高濃度的鹽會(huì)嚴(yán)重抑制PCR反應(yīng)，所以基因組DNA必須用70%乙醇多次洗滌以除去這些雜質(zhì)。

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Efficient method for isolation of genom ic DNA from tender tea leaves rich in secondary metabolites

TANG Xiangkai1，2，TAN Heping1，2，SHEN Xingzhong2，LI Huaiping1，2，XU Yang1，2，GUAN Chi1，2
（1.Standard and Testing Technology of Tea Key Laboratory of Sichuan Province，Chengdu 610021，China；2.National Institute of Measurement and Testing Technology，Chengdu 610021，China）

An efficient method for isolation of genomic DNA from tender tea leaves rich in secondary metabolites is established.First，the cells of tea leaves were grinded quickly and uniform ly with a 6770 Freezer/Mill at low temperature.The difficulty of how to avoid the oxidation and browning of polyphenols has hence solved.Additionally，β-mercaptoethanol and other antioxidants were added into an extraction buffer to prevent the polyphenols from oxidizing.After several purification steps，impurities，such as polyphenols，polysaccharides，and proteins，were removed.The genomic DNA extracted from tea leaves is intact，pure and suitable for restriction digestion and polymerase chain reaction.Moreover，the systematic methodological study has indicated that the method is stable，reliable，and reproducible.The study has laid a foundation for the establishment of a standard method to extract genomic DNA from young leaves of tea.

DNA extraction；tea；methodology；stability analysis

A

1674-5124（2015）09-0047-04

2015-03-09；

2015-04-17

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2008BAK41B01-7）；四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2009NZ0015）

唐祥凱（1986-），男，四川成都市人，碩士，主要從事茶樹(shù)生物技術(shù)研究。

譚和平（1957-），男，重慶市人，研究員，享受國(guó)務(wù)院政府津貼專家，從事生物化學(xué)茶產(chǎn)業(yè)鏈研究。