基于移動終端的麻痹性貝類毒素現(xiàn)場快速檢測系統(tǒng)設計*

鄒瞿超，方佳如，蘇凱麒，周　潔，胡　寧，裘利堅，王　平（浙江大學，生物傳感器國家專業(yè)實驗室，生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室，生儀學院，杭州310027）

基于移動終端的麻痹性貝類毒素現(xiàn)場快速檢測系統(tǒng)設計*

鄒瞿超，方佳如，蘇凱麒，周潔，胡寧，裘利堅，王平*
（浙江大學，生物傳感器國家專業(yè)實驗室，生物醫(yī)學工程教育部重點實驗室，生儀學院，杭州310027）

為實現(xiàn)食品中毒素的現(xiàn)場快速檢測，設計了一種基于移動終端的麻痹性貝類毒素現(xiàn)場高通量快速檢測系統(tǒng)。采用PSP試劑盒對毒素進行顯色反應，實現(xiàn)了一定濃度范圍內(nèi)的毒素檢測；采用暗室結構，配合面光源透射，提供了穩(wěn)定的檢測環(huán)境；采用具有較高像素攝像頭的移動終端對反應結果進行采集和處理，實現(xiàn)了檢測結果的精確分析和高效交互。以實際樣品作為對象進行了系統(tǒng)的功能測試，并與商用酶標儀的結果進行了對比，證明該系統(tǒng)能夠較為準確地測得樣品中麻痹性毒素的濃度，且檢測速度較快，靈敏度較高。結果表明，本系統(tǒng)操作簡單，且具有較高的靈敏度、檢測速度和通量，能在現(xiàn)場實現(xiàn)麻痹性貝類毒素的快速檢測，為食品安全評估提供了一種高效的初篩手段。

生物傳感器；麻痹性貝素；試劑盒；移動終端

EEACC:7230Jdoi:10.3969/j.issn.1004-1699.2015.09.001

麻痹性貝毒（Paralytic shellfish poison，PSP）是一類對人體神經(jīng)肌肉產(chǎn)生麻痹作用的海洋生物毒素，其對人體的作用機理主要表現(xiàn)為阻斷神經(jīng)細胞鈉離子通道，從而造成神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙［1］。PSP是所有海洋生物毒素中分布最廣、危害最大的幾類毒素之一，主要由海洋中的單細胞甲藻產(chǎn)生，并通過貝類對有毒藻的濾食在其體內(nèi)持續(xù)積累，進而通過食物鏈的富集作用威脅到人們的食品安全和身體健康［2-3］。近年來，我國的東南沿海地區(qū)多次發(fā)生了因食用染毒貝類引發(fā)的消費者中毒甚至死亡事件［4-5］。為了實現(xiàn)食品中PSP毒性的有效評估，設計一種高效準確的檢測系統(tǒng)是十分必要的。

隨著各方面技術的飛速發(fā)展，出現(xiàn)了多種實現(xiàn)PSP毒性有效評估的檢測方法。較為傳統(tǒng)的毒素檢測方法是小白鼠生物試驗法，該方法于1980年得到美國分析化學家協(xié)會AOAC（Association of Official Analytical Chemists）的推薦［6］，并被包括我國在內(nèi)的許多國家接受和采用，成為檢測PSP的標準方法。但該方法也有較多的限制，如不能確定樣品中毒素結構；提取液的pH值、鹽含量以及其他金屬離子均會對毒性判斷產(chǎn)生影響；不同小鼠的品系、批次、損傷程度和大小也對測定結果有影響等［7-9］。而高效液相色譜-質譜聯(lián)用的方法與前者相比具有靈敏度高、結果準確可靠、可確定各種毒素成分、所需檢測的樣品量少等優(yōu)勢，已被國際上廣泛接受。該方法存在的問題是PSP分析標準品全球缺乏，由于各種PSP類似物的毒性種類唯一，很多類似物較易相互轉化，樣品中的原始或潛在總毒性難以作出判斷［10-12］。而免疫分析法通過抗原抗體反應具有高特異性與靈敏度，可分為血球凝聚、放射免疫分析（RIA）和酶聯(lián)免疫分析（ELISA），但該方法使用過程中獲得其特殊的單克隆抗體較為困難并且實驗中易出現(xiàn)假陽性［13-16］。此外，其他技術如細胞傳感器等也被用于貝類毒素的檢測。細胞傳感器利用活細胞作為敏感元件感應到細胞外微環(huán)境的波動，從而能夠通過檢測毒素對細胞狀態(tài)的影響來高效地評估毒性的大小，具有新型的、高一致性、高通量等特點，是對傳統(tǒng)方法的很好補充［17-19］。目前，麻痹性貝類毒素檢測中較為可靠和常用的儀器是高效液相色譜儀，該設備配合上述高效液相色譜-質譜聯(lián)用的方法可獲得較高檢測精度和較為全面的檢測參數(shù)，但是其儀器結構復雜，價格非常昂貴，檢測耗時較長，檢測費用也較高，且對待測樣品前處理有較高要求，不利于將其發(fā)展為現(xiàn)場檢測技術。而酶標儀作為應用廣泛的光學檢測儀器常被用于溶液濃度的檢測，配合ELISA方法也被用于實驗室內(nèi)的麻痹性貝類毒素濃度評估，但其體積相對較大不便攜，多通道檢測時速度較慢，數(shù)據(jù)處理較為復雜，也不適合樣品的現(xiàn)場快速檢測和篩選。因此，目前尚未有適合用于現(xiàn)場的便攜式檢測系統(tǒng)來實現(xiàn)待測貝肉樣品中麻痹性貝類毒素濃度的快速、可靠評估。

本文基于免疫分析技術設計一種麻痹性貝類毒素現(xiàn)場檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)以移動終端作為分析平臺，具有通量高、速度快、操作簡單、便攜等特點，用于麻痹性貝類毒素的現(xiàn)場快速檢測，是對水產(chǎn)品毒性檢測方法的補充和發(fā)展。本文將詳細介紹該系統(tǒng)的原理和組成，并且通過系統(tǒng)性能測試及毒素檢測實驗驗證系統(tǒng)的可行性。

1　材料和方法

1.1試劑與儀器

麻痹性毒素檢測試劑盒Abraxis BioScience，異丙醇，冰醋酸，純水，低溫離心機，拍擊式均質器，微量進樣器，電子天平，振蕩器，現(xiàn)場檢測系統(tǒng)，酶標比色儀。

1.2方法

1.2.1測定原理

檢測的基礎為抗原抗體反應，微孔板上固定有PSP抗體的捕捉抗體，在加入標準溶液或樣品提取液和PSP酶標記物之后，游離的PSP將與PSP酶標記物競爭結合PSP抗體，而PSP抗體同時與捕捉抗體連接，未結合的酶標記物在洗滌過程中被除去。將酶基質和顯色劑加入微孔中孵育，一定時間后加入終止溶液，溶液的顏色狀況將與樣品中毒素的濃度存在對應關系，通過自制現(xiàn)場檢測系統(tǒng)采集溶液顏色圖像并進行合適的分析，即可對樣品中的毒素濃度進行評估。

1.2.2貝肉樣品前處理

除去樣品貝殼，將貝肉置于收集器中瀝水，5 min后去除碎屑組織，并進行均質，取10 mL備用。向10 mL均質液中加入10 mL萃取液（70%異丙醇:5%冰醋酸=5∶2），并振蕩，使均質液與萃取液均勻混合。在4℃下，3 500 G離心10 min，收集上清液。上清液過濾，取100 μL濾液，用樣品稀釋緩沖液稀釋到2.5 mL（25倍稀釋，針對樣品中毒素濃度不同，可選擇不同的稀釋倍數(shù)，以擴展檢測范圍）。取50 μL稀釋后的濾液作為樣品溶液用于試劑盒分析。重復上述步驟，可獲得多個待測樣品溶液。

1.2.3準備待測檢測板

將所有試劑置于室溫（20℃～28℃）下，從鋁箔袋中拿出一條微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。分別吸取50 μL的濃度為0，0.02× 10-9，0.04×10-9，0.08×10-9，0.16×10-9，0.32×10-9的標準品依次加到對應微孔條中，用于確定試劑盒檢測貝類麻痹性毒素的標定曲線，必須保證每種溶液使用干凈的吸頭吸取，避免交叉污染。將前述步驟中的樣品溶液加到其余微孔條中，吸取50 μL酶標記物到微孔板的每個孔中，然后加入50 μL抗體溶液到每個小孔中，混勻，在20℃～28℃下孵育30 min。孵育完后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板緩沖液（含有0.05%Tween-20的PBS溶液）清洗，每個微孔至少加入250 μL，震蕩后倒掉并倒置在吸水紙上拍打，重復三至四次。在吸水紙上拍打，盡可能將水拍干，然后，每個微孔中加入100 μL顯色溶液，在20℃～28℃下避光孵育30 min。孵育完成后，往每個微孔中加入100 μL的終止溶液，即準備好試劑盒96孔檢測板用于樣品溶液濃度的檢測。

1.2.4待測樣品快速檢測

使用現(xiàn)場檢測系統(tǒng)進行檢測，將準備好的試劑盒96孔檢測板放置在檢測裝置的適配器上，開啟光源，然后使用智能移動設備采集試劑盒96孔檢測板的圖像，并在分析軟件中進行處理，即可計算出樣品溶液貝類腹瀉性毒素的濃度，根據(jù)樣品前處理步驟的稀釋倍數(shù)（如1 mL樣品溶液的毒素等于1 g去殼貝肉樣品的毒素），即可得到去殼貝肉所含有的貝類腹瀉性毒素的含量。

1.3系統(tǒng)設計

本系統(tǒng)組成主要包括運行于移動終端的檢測軟件、提供穩(wěn)定檢測環(huán)境的檢測裝置以及作為傳感器件和檢測對象的試劑盒三部分。如圖1所示。試劑盒即為上文中所述的麻痹性毒素檢測試劑盒。下面將分別就分析軟件和檢測裝置的設計進行詳細介紹。

圖1　系統(tǒng)實物圖

1.3.1檢測軟件設計

本系統(tǒng)的檢測軟件（圖2）運行于移動終端Iphone，采用Objective-C語言進行開發(fā)。Objective-C是一種通用、高級、面向對象的編程語言，擴展了標準的ANSI C編程語言，并將Smalltalk式的消息傳遞機制加入到ANSI C中，是蘋果公司OSX和iOS操作系統(tǒng)，及其相關API、Cocoa和Cocoa Touch的主要編程語言?；贠bjective-C語言與Iphone所用iOS操作系統(tǒng)之間的緊密關系，本系統(tǒng)的檢測軟件可以方便地調用移動終端的相關軟硬件資源實現(xiàn)信息采集、處理和交互。

軟件的信息采集功能主要是控制智能終端的高像素后置攝像頭采集檢測結果。軟件可控制攝像頭進行特定流程的感光和自動對焦從而獲得穩(wěn)定的反應圖像，需要時也可以對反應過程進行較長時間的觀察和記錄。由于檢測時試劑盒幾十個孔的反應過程都在同一幀圖像內(nèi)出現(xiàn)，可以通過本系統(tǒng)實現(xiàn)真正的實時同步高通量檢測。

軟件的信息處理功能可以分成兩個部分:建立標定曲線和對比確定實際樣品濃度。

首先，使用顏色比率與濃度（其以10為底的對數(shù)）之間的關系來確定檢測毒素的標定曲線。其中顏色比率與圖像像素之間的關系如下

式中:Cr（n）是濃度為n的標準品的顏色比率，Ck（n）是濃度為n的標準品的子圖像R分量平均值（標準樣品為0.02×10-9，0.04×10-9，0.08×10-9，0.16×10-9，0.32× 10-9五個濃度標準品組成的梯度），C0為0的標準品孔的子圖像R分量平均值。處理時切割出標準品孔所對應的子圖像，子圖像為孔內(nèi)像素范圍為10×10的圖像；將各子圖像分別轉換至顏色孔間RGB，提取各子圖像中每個像素的R分量，并計算各子圖像像素R分量平均值Ck（n）；根據(jù)上式計算五個標準品溶液顏色比率Cr（n）；根據(jù)最小二乘法擬合曲線算法，擬合出Cr（n）關于標準品濃度n以10為底的對數(shù)的標定曲線，即系統(tǒng)檢測毒素的標定曲線。

其次，計算待測樣品孔的顏色比率，并對照標定曲線得到待測樣品溶液的毒素濃度。待測樣品孔顏色比率與其圖像像素之間的關系如下

式中:Cr（i）是第i個待測樣品的顏色比率，Ck（i）是第i個待測樣品的子圖像R分量平均值，C0為0的標準品孔的子圖像R分量平均值。處理時切割出的樣品溶液孔子圖像，子圖像同樣為孔內(nèi)像素范圍為10×10的圖像；將子圖像轉換至顏色孔間RGB，提取子圖像中每個像素的R分量，并計算子圖像像素R分量平均值Ck（i）；根據(jù)上式計算待測樣品溶液顏色比率Cr（i）；將待測樣品溶液的Cr（i）值代入系統(tǒng)檢測毒素的標定曲線，計算出樣品中的毒素濃度，即可完成對應樣本毒素濃度的檢測。重復上述步驟，可完成多樣本的高通量檢測。

軟件的交互功能表現(xiàn)為用戶可通過操作界面對整個檢測流程進行控制，并獲取檢測結果。圖3（A）是軟件啟動時的界面圖，圖中標示了毒素檢測的整個流程。圖3（B）為軟件的主界面，其中區(qū)域1是檢測通道選擇區(qū)域，可點擊某一通道得到該通道的檢測結果；區(qū)域2是檢測操作區(qū)域，可完成系統(tǒng)的標定曲線校準、實際樣品檢測和數(shù)據(jù)上傳等功能；區(qū)域3是結果顯示區(qū)域，顯示了當前的通道和該通道檢測結果。點擊主界面區(qū)域2中的“Calibrate”按鈕可計入標定曲線校準界面圖（圖3（C）），其中區(qū)域4是標定曲線顯示區(qū)域，顯示了當前的標定曲線情況；區(qū)域5是參數(shù)選擇區(qū)域，可改變檢測對象和對應的衡量參數(shù)以便重新校準。用戶可通過對上述界面的相應操作完成樣品的毒素檢測，得到待測樣品中的毒素濃度。

圖3　軟件界面圖

1.3.2檢測裝置設計

為了保證檢測結果的一致性，排除環(huán)境干擾，并為智能終端提供合適的檢測位置，設計了試劑盒檢測的檢測裝置（圖4（A）），如圖4（B）所示包括:智能移動設備適配器2、暗室上蓋3、試劑盒適配器5、冷光片6、試劑盒裝載臺7、暗室底座8和控制器9。其中，智能移動設備適配器2用于固定移動終端1的檢測位置；暗室上蓋3與暗室底座8組成暗室，屏蔽外界環(huán)境光對檢測的干擾；控制器9需12 V電壓源供電，可驅動冷光片6發(fā)出均勻白光為圖像采集提供光源；冷光片6具有不產(chǎn)生熱量、不含紫外線、發(fā)光效率高、功耗低等特點，亮度80 cd/m2左右，且不均勻性在±5%以內(nèi)，滿足檢測要求；試劑盒適配器5和試劑盒裝載臺7可固定待測試劑盒4的檢測位置，保證試劑盒4與移動終端1相對位置固定且間距為移動終端1后置攝像頭成像較為清晰的焦距長度，并方便檢測過程中試劑盒4的裝卸更換。該裝置的結構在固定了試劑盒的檢測區(qū)域與智能終端攝像頭之間的位置關系的同時，保證智能終端能采集到所有樣品圖像，并為成像提供均勻光照，從而保證檢測結果的穩(wěn)定性和可靠性。

圖4　試劑盒檢測裝置示意圖

2　結果與討論

2.1性能測試

系統(tǒng)性能測試實驗采用0.02×10-9，0.04×10-9，0.08×10-9，0.16×10-9，0.32×10-95個濃度的毒素標準品溶液建立貝類麻痹性毒素檢測的標定曲線，并使用0.01×10-9、0.03×10-9、0.1×10-9、0.2×10-94個已知濃度的樣品對標準曲線和檢測系統(tǒng)進行功能驗證。圖5為系統(tǒng)檢測過程中建立的標定曲線，表1為系統(tǒng)性能測試中四個已知濃度樣品的檢測和對比結果。系統(tǒng)性能測試實驗中標定曲線的線性度達到0.9 713，已知濃度樣品檢測結果的相對誤差均在20%以內(nèi)。

2.2貝類麻痹性毒素檢測

使用現(xiàn)場檢測系統(tǒng)與酶標儀對同樣的8個實際貝肉樣品進行貝類麻痹性毒素檢測，并將酶標儀的結果作為控制組進行對照。使用0.02×10-9，0.04×10-9，0.08×10-9，0.16×10-9，0.32×10-95個濃度的毒素標準品溶液分別建立兩套系統(tǒng)的毒素檢測標定曲線，如圖6所示，兩條曲線的趨勢基本一致，且線性度皆高于0.95，其中現(xiàn)場檢測系統(tǒng)的線性度為0.9 649，酶標儀的線性度為0.9 582，現(xiàn)場檢測系統(tǒng)標定曲線的線性度略高于酶標儀的標定曲線。此外，現(xiàn)場檢測系統(tǒng)的標定曲線斜率為-0.355，截距為0.3 938；而酶標儀的標定曲線斜率為-0.5 085，截距為-0.025 36，可見現(xiàn)場檢測系統(tǒng)還具有較高的檢測靈敏度。

圖5　系統(tǒng)性能測試的標定曲線

表1　已知濃度樣品驗證結果

圖6　酶標儀與現(xiàn)場檢測系統(tǒng)標定曲線對比

8個實際樣品的檢測結果如表2、表3所示。其中，表2為兩套系統(tǒng)直接測得的結果，考慮到為擴展檢測范圍，前處理流程中將樣品溶液進行了稀釋，實際為樣品稀釋150倍后的結果，從表中可以看出，現(xiàn)場檢測系統(tǒng)的結果與酶標儀基本一致，相對誤差在20%以內(nèi)。表3為表2中直接測得的結果經(jīng)換算后得到的各個去殼貝肉樣品中的毒素濃度，兩套系統(tǒng)的結果仍保持較好的同步性，且與換算前兩者間的關系基本一致，相對誤差仍在20%以內(nèi)，滿足檢測要求，達到實驗的預期目的。

表2　實際樣品溶液中毒素檢測結果對比（稀釋150倍，單位×10-9）

表3　實際樣品貝肉中毒素檢測結果對比（換算后，單位μg/kg）

3　結論

本文介紹了一種基于移動終端的麻痹性貝類毒素現(xiàn)場檢測系統(tǒng)，結合免疫分析技術中的酶聯(lián)免疫分析（ELISA）方法和移動終端的優(yōu)勢，致力于建立麻痹性貝類毒素的現(xiàn)場快速分析平臺，用于該毒素樣品的初篩和毒性評價。本系統(tǒng)包括檢測軟件和檢測裝置，在完成系統(tǒng)性能測試后，還對麻痹性貝類毒素實際樣品進行了檢測試驗，并將實驗結果與酶標儀的檢測結果進行了對比。研究結果表明，基于移動終端的麻痹性貝類毒素現(xiàn)場檢測系統(tǒng)具備方便快速、高靈敏度、高通量測量等特點，為麻痹性貝類毒素的樣品初篩和檢測提供了新的有效手段。

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鄒瞿超（1990-），男，浙江大學，碩士研究生，主要研究方向為生物傳感器與系統(tǒng)，cnqczou@zju.edu.cn；

王平（1962-），男，浙江大學，教授，博士生導師，主要研究方向為傳感器與檢測技術、生物芯片與生物電子學、人工嗅覺與人工味覺等，cnpwang@zju.edu.cn。

Design and Implementation of an In-Suit Paralytic Shellfish Poison Detection System Based on Mobile Terminal*

ZOU Quchao，F(xiàn)ANG Jiaru，SU Kaiqi，HU Ning，QIU Lijian WANG Ping*
（Biosensor National Laboratory，Key Laboratory of Biomedical Engineering of Education Ministry，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China）

For the in-suit detection of the paralytic shellfish poison（PSP），a system based on mobile terminal is designed to realize high-throughput quick analysis of the toxin.Chromogenic reaction of PSP kit with the toxin can achieve the concentration within appropriate scope.A darkroom with an area light source can provide a stable testing environment.A mobile terminal with high megapixel camera for data collection and processing can realize accurate analysis of the testing results and efficient interaction.Finally，toxin detection experiments with shellfish samples used to certify the availability of the system.The results showed that the system had several attributes such as in-suit fast detection，simple operation，high sensitivity and applied a new detection platform for PSP of food.

biosensor；paralytic shellfish poison；kit；mobile terminal

R318

A

1004-1699（2015）09-1269-06

項目來源:海洋公益項目（201305010）

2015-04-29修改日期:2015-06-24