板藍(lán)根多糖的化學(xué)分離及其免疫增強(qiáng)活性的研究

徐藝銓

(江陰市中醫(yī)院 江蘇無(wú)錫 214400)

板藍(lán)根是一種重要的清熱解毒藥物,具有較好的抗病毒效果,其對(duì)特異性免疫和非特異性免疫都有一定的促進(jìn)作用,再有,板藍(lán)根多糖在抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)、防治炎癥疾病方面具有很好的療效[1]。目前對(duì)板藍(lán)根多糖的提取多采用水煎純沉工藝,但是該方法對(duì)多糖的質(zhì)量控制并不理想,也給板藍(lán)根多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用造成了一定的困難。本文即是對(duì)板藍(lán)根多糖提取工藝進(jìn)行分析,并對(duì)其體外免疫增強(qiáng)活性進(jìn)行考察,現(xiàn)將相關(guān)情況報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本組實(shí)驗(yàn)選取的板藍(lán)根藥材為十字花科植物菘藍(lán)的干燥根,所用儀器包括紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、真空泵、真空干燥箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱、電子分析天平、離心機(jī)、壓力蒸汽滅菌器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和全自動(dòng)酶標(biāo)儀;試劑包括硫酸、苯酚、甲醇、乙醇等分析純,以及自制板藍(lán)根多糖、蒸餾水、胎牛血清、刀豆素、紅細(xì)胞裂解液;細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、YAC-1細(xì)胞和NK細(xì)胞;試驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c小鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定板藍(lán)根多糖含量

采用顯色方法測(cè)定板藍(lán)根多糖含量,即在供試液中加入5%苯酚1ml,搖勻后再加入濃硫酸5ml,靜置待測(cè);制備對(duì)照品和供試品溶液,前者濃度為0.1mg/ml,后者濃度為0.4mg/ml;精密吸取對(duì)照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml和0.8ml置入1比色管中,各加蒸餾水調(diào)至2ml,搖勻后再加入5%苯酚1ml和濃硫酸5ml,利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液濃度,分析其線性關(guān)系;取供試品溶液進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),并分別在0、1、2、3、5h利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液濃度,觀察板藍(lán)根多糖顯色效果的穩(wěn)定性;最后采用重量法測(cè)定浸膏得率,分析各因素對(duì)多糖提取效果的影響[2]。

1.2.2 免疫增強(qiáng)活性實(shí)驗(yàn)

①制備淋巴細(xì)胞:脫頸處死小鼠,放入75%乙醇中浸泡;剪開(kāi)小鼠左腹部,取出脾臟進(jìn)行培養(yǎng);吸取上層淋巴細(xì)胞懸液于試管內(nèi),并加入紅細(xì)胞裂解液5ml,加入培養(yǎng)基;清洗淋巴細(xì)胞并計(jì)數(shù),稱取20mgIIF,溶入5ml蒸餾水中,配成儲(chǔ)備液,按照1:1比例與PBS混合,對(duì)IIF溶液進(jìn)行稀釋,置于4℃溫度下保存待用;稱取5mg刀豆素A,置于5mlPBS溶液中,將其作為陽(yáng)性對(duì)照儲(chǔ)備液;觀察淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)情況,檢測(cè)其上清液中IL-10和IFN-的含量[3]。②檢測(cè)IL-10:取不同濃度IIF溶液作為藥物組,將加入刀豆素A和淋巴細(xì)胞懸液作為陽(yáng)性對(duì)照組,將加入PBS和淋巴細(xì)胞懸液作為陰性對(duì)照組,吸取三組上清到EP管中,去除聚合物后收集上清;配置標(biāo)準(zhǔn)品,與各組同時(shí)置于18～25℃中孵育2h;配置HRP,孵育,檢測(cè)OD值。③檢測(cè)IFN-:其方法與IL-10基本一致[4]。

2 結(jié)果

多糖含量測(cè)定結(jié)果顯示,葡萄糖在0.1～0.8mg/ml之間的線性關(guān)系較好,回歸方程計(jì)算的供試品中多糖的含量為5mg,為取樣量的1/2,采用硫酸-苯酚法顯色后,1h前溶液檢測(cè)結(jié)果未發(fā)生變化,2h后開(kāi)始降低,為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,溶液必須在顯色后1h內(nèi)檢測(cè);浸膏得率受溫度、提取時(shí)間和加水量等因素影響,其中,溫度越高、提取時(shí)間越長(zhǎng),浸膏得率越大,加水量在10倍時(shí),浸膏得率變化較小。根據(jù)上述工藝,稱取板藍(lán)根藥材4kg,得到促多糖為583.8g,得率約為15%。

免疫增強(qiáng)活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IIF低濃度組與陰性對(duì)照組比較,細(xì)胞上清液中的IL-10含量得到明顯提高,隨著藥物濃度的不斷增高,其含量并未隨著增加,在4.5μg/ml時(shí),含量達(dá)到最高,表明此過(guò)程無(wú)明顯的濃度依賴性;藥物組與陰性對(duì)照組相比,細(xì)胞上清液中的IFN-I含量并未提高,各組差異并不明顯;三組NK細(xì)胞活性相比,藥物組明顯高于陰性對(duì)照組,略小于陽(yáng)性對(duì)照組,表明IIF能夠提高NK細(xì)胞的活性。

3 討論

本研究采用硫酸-苯酚法測(cè)定板藍(lán)根多糖含量,通過(guò)線性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度的考察,該方法的可靠性得以證實(shí),并以浸膏得率為指標(biāo),通過(guò)對(duì)溫度、提取時(shí)間和加水量等因素的考察,建立了多糖提取的最佳工藝條件,即溫度為100℃,用水量為10倍,共煎煮2次,每次2.5h。免疫增強(qiáng)活性實(shí)驗(yàn)證實(shí),IIF能夠提高淋巴細(xì)胞分泌IL-10的含量,促進(jìn)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答,從而產(chǎn)生免疫效應(yīng),而且其對(duì)IFN-I含量的影響并不大。

綜上所述,板藍(lán)根多糖具有一定的體液免疫作用,并能夠提高NK細(xì)胞的活性,增強(qiáng)其對(duì)病毒的吞噬能力,能夠更好地發(fā)揮抗病毒的功效。

[1]何立巍,李祥,王洪蘭,等.板藍(lán)根多糖的結(jié)構(gòu)特征及活性研究[J].中國(guó)中藥雜志,2011,16(5):2179-2182.

[2]李娟.板藍(lán)根多糖的分離純化及抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性的研究[D].東北師范大學(xué),2013.

[3]朱婷.板藍(lán)根多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)及佐劑活性的研究[D].中南大學(xué),2013.

[4]陳智,陳凱,田景振.凍融-酶解-膜分離復(fù)合技術(shù)純化板藍(lán)根多糖的工藝優(yōu)選[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,14(5):42-44.