DNA甲基化標(biāo)志物的無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)在肺癌早期診斷中的應(yīng)用

周曉萌 黃家強(qiáng)

(北京交通大學(xué) 北京 100044)

1 背景

肺癌已成為危害人類(lèi)生命健康的一種主要疾病,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。肺癌患者5年生存率僅有15%。靈敏特異的無(wú)創(chuàng)性早期篩查手段有助于提高癌癥患者的生存率。近年來(lái)的研究呈現(xiàn)愈加繁雜的候選分子遺傳和表觀遺傳標(biāo)志物及其組合,為肺癌的早期診斷提供了新的契機(jī)與挑戰(zhàn)[1]。理想的早期診斷標(biāo)志物應(yīng)具有較高的組織特異性。而理想的早期診斷應(yīng)是運(yùn)用無(wú)創(chuàng)性方法取得標(biāo)本,通過(guò)檢測(cè)敏感且具有組織特異性的分子標(biāo)志物,提示人體內(nèi)早期可能存在的異常變化及潛在威脅。近年來(lái)DNA甲基化標(biāo)志物在肺癌的早期診斷發(fā)揮越來(lái)越重要的作用,為發(fā)展無(wú)創(chuàng)性方法研究特異性肺癌早期標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)[1,2]。

2 肺癌早期的無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)

2.1 肺癌病人血液中DNA甲基化的檢測(cè)

腫瘤細(xì)胞可釋放DNA到血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi),在癌癥病人血清和血漿內(nèi)可以檢測(cè)到異常的較高濃度的循環(huán)DNA[3]。Usadel H等通過(guò)比較研究發(fā)現(xiàn),基因APC的啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化(以下簡(jiǎn)稱DNA甲基化)在肺癌組織與對(duì)應(yīng) 血清、血漿樣本中具有相似的改變模式[4],提示血液樣本內(nèi)相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)的變化可作為腫瘤早期篩選的標(biāo)志物。多項(xiàng)研究先后發(fā)現(xiàn)APC,AIM1,CDH1,CDH13,DAPK1,DCC,GSTP1,FHIT,MGMT,p16,RARβ2,RASSF1A和WIF1等基因在肺癌病人血液樣本中呈現(xiàn)高DNA甲基化,而在良性肺疾病患者或健康人血清中則很少甚至檢測(cè)不到[5-8]。但利用血液樣本中單個(gè)基因DNA甲基化狀態(tài)評(píng)估肺癌,存在著敏感性較低的問(wèn)題,通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)基因DNA甲基化狀態(tài)即表觀遺傳標(biāo)志物組合有望兼顧肺癌早期診斷的敏感性和特異性[6-8]。如肺癌病人血清內(nèi)單基因DCC的DNA甲基化用于肺癌檢測(cè),雖特異性高達(dá)100%,但敏感性僅有35.5%,而通過(guò)聯(lián)合評(píng)估5個(gè)基因APC,CDH1,MGMT,RASSF1A和AIM1的甲基化狀態(tài),可使檢測(cè)肺癌的敏感性提高到75%,特異性也可達(dá)到73%[7]。

目前鑒定血液中DNA甲基化作為檢測(cè)早期肺癌的標(biāo)志物亟待解決兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。首先是能否有效收集到肺癌發(fā)生早期過(guò)程中血液循環(huán)DNA并檢測(cè)相關(guān)DNA甲基化變化。其次是待檢基因的組織特異性,因?yàn)檠簶?biāo)本不具有器官特異性,在血液中檢測(cè)出的DNA甲基化變化可能源于某個(gè)或多個(gè)組織,如在肺癌患者血液中檢測(cè)到基因APC和RUNX3 DNA甲基化變化,也可在其它癌癥中同時(shí)檢測(cè)到[4,9]。近年來(lái)組織特異差異甲基化區(qū)域(tissue-specific differentially methylated regions, T-DMRs)在決定基因特異性表達(dá)、細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育中的調(diào)控作用逐漸引起關(guān)注[10,11],T-DMRs的異常可能導(dǎo)致腫瘤相關(guān)基因的異常表達(dá)并可能呈現(xiàn)基因特異性,為解決DNA基因甲基化作為早期診斷標(biāo)志物的組織特異性問(wèn)題提供了有利線索。

2.2 肺癌病人痰液中DNA甲基化的檢測(cè)

許多吸煙者和既往吸煙者支氣管分泌物增加,產(chǎn)生的痰液含有來(lái)自下呼吸道內(nèi)的脫落細(xì)胞,這使得痰液分子與細(xì)胞學(xué)發(fā)展成為生物標(biāo)志物研究的活躍領(lǐng)域之一[12]。如研究發(fā)現(xiàn)在肺癌病人痰液樣本和組織樣本內(nèi)均可檢測(cè)出基因p16異常高DNA甲基化,而在良性肺疾病患者或無(wú)癌健康人痰液樣本內(nèi)均未檢出[13]。雖然多項(xiàng)研究均報(bào)道多種腫瘤都伴有p16高DNA甲基化現(xiàn)象,但聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估多個(gè)基因DNA甲基化同樣的有利兼顧肺癌診斷的靈敏性和特異性。如以p16、MGMT、DAPK、RASSF1A、PAX5和GATA5這6個(gè)基因DNA甲基化作為評(píng)價(jià)指標(biāo),其中3個(gè)基因DNA甲基化陽(yáng)性的病患發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加6.5倍,用于高風(fēng)險(xiǎn)人群的肺癌發(fā)病率驗(yàn)證性篩查的敏感性和特異性達(dá)到65%[13]。

痰液作為肺癌的篩選工具有以下優(yōu)勢(shì):首先是痰液易于通過(guò)無(wú)創(chuàng)性方法獲得,其次痰液內(nèi)含有來(lái)自肺和下呼吸道的細(xì)胞,具有較高的肺組織特異性。然而不足之處就是痰液中的細(xì)胞主要來(lái)自肺中心部位,因此可能不適合檢測(cè)發(fā)生在肺周?chē)南侔?而對(duì)于發(fā)生在肺中心部位的鱗癌可能會(huì)有更高的診斷價(jià)值。

2.3 前景

DNA甲基化已成為癌癥早期診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物。通過(guò)人體體液無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)肺癌內(nèi)異常DNA甲基化,有望成為一種優(yōu)于其它檢測(cè)方法的肺癌早期篩查手段,但是挑戰(zhàn)依然存在。首先是由于受試對(duì)象年齡,性別,吸煙史,所處的病理階段等的不同,研究者在不同群體所得到的甲基化率差異很大,需要建立系統(tǒng)完善的臨床調(diào)查體系,規(guī)范標(biāo)本及臨床信息收集與樣本檢測(cè);其次是嘗試用于肺癌早期診斷的基因DNA甲基化的改變無(wú)法確定肺組織特異性甚至相關(guān)性,采用大規(guī)模臨床標(biāo)本的進(jìn)一步篩查驗(yàn)證,存在時(shí)效與準(zhǔn)確性諸多問(wèn)題;最后DNA甲基化尤其是T-DMRs調(diào)控基因的細(xì)胞組織特異性及其與肺癌特異的相關(guān)性研究甚少,系統(tǒng)比較正常與肺癌組織中T-DMRs,可能有助于克服上述存在的時(shí)效與準(zhǔn)確性等問(wèn)題。

目前隨著高通量測(cè)序及微量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,使得系統(tǒng)繪制各種腫瘤的全基因組比較甲基化圖譜成為可能。組織,器官和個(gè)體特異性的甲基化標(biāo)志物有望被鑒定出來(lái)用于肺癌的早期診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)。最近一項(xiàng)研究表明,RASSF1A基因DNA甲基化用于肺癌病人痰液樣本檢測(cè),敏感性達(dá)45%,結(jié)合細(xì)胞學(xué)診斷 則可提高到52%,而且保持相似的特異性(94%)[14],提示通過(guò)充分結(jié)合肺癌早期病理變化特點(diǎn)與體液標(biāo)本的來(lái)源,優(yōu)化匹配相應(yīng)的甲基化標(biāo)志物組合,有助于提高肺癌早期診斷的特異性與敏感性,為表觀遺傳學(xué)應(yīng)用于肺癌的精準(zhǔn)醫(yī)療提供強(qiáng)有力工具。

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