海洋內(nèi)生放線菌fang-1的次生代謝產(chǎn)物研究

畢淑峰，朱廣琪，呂永展

（黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山245041）

放線菌是一類能產(chǎn)生多種類型活性成分的革蘭氏陽性菌，在已發(fā)現(xiàn)的活性次生代謝產(chǎn)物中很多都是放線菌產(chǎn)生的[1]。從陸生放線菌中分離得到的先導(dǎo)化合物的數(shù)量銳減，于是人們把目光投向了更為廣闊的生境—占地球面積的70%的海洋[2]。海洋高鹽度、高壓等特點使海洋微生物形成獨特的代謝途徑，近年已從海洋放線菌中分到了很多結(jié)構(gòu)新穎、活性好的新化合物。本實驗對海洋內(nèi)生放線菌fang-1 次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，得到6 個化合物，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，均為首次從該放線菌中分離得到。

1 主要儀器與試劑

Bruker DRX-500 型超導(dǎo)核磁共振儀 （德國Bruker 公司），高效液相色譜[UV detector L-7400和Apollo C18-5 μm，Hitachi pump L-7100，日本日立公司]，SW-CJ-2FD 雙人單面凈化工作臺（蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司），Agilent6210 TOF LC/MS 液質(zhì)聯(lián)用儀 （美國Agilent 公司），大孔樹脂XAD-7（美國Amberlite 公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELA N-1000，（東京理化器械株式會社），TH-3560 立式高壓滅菌鍋[造鑫(鑫科) 企業(yè)有限公司]，Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia 生物科技公司）。

氘代試劑均由美國Merk 公司生產(chǎn)，HPLC 色譜純試劑由美國天地試劑公司生產(chǎn)，其他甲醇、乙酸乙酯、氯仿等均是國產(chǎn)分析純。

2 菌株發(fā)酵

將fang-1 菌種接種于約裝有0.4L 培養(yǎng)基的1 L 錐形瓶中，培養(yǎng)基的主要成分為蛋白胨、蔗糖和酵母膏。在28±1℃溫度下震蕩培養(yǎng)48h，將種子培養(yǎng)液接種到約裝有0.4L 培養(yǎng)基（主要成分為蛋白胨、蔗糖和酵母膏）的1L 錐形瓶中發(fā)酵培養(yǎng)，一周后收集發(fā)酵液，并離心除去固體菌絲體，得到約50L 深褐色發(fā)酵液。

3 提取與分離

每0.5L 發(fā)酵液中加入20.0g 大孔樹脂，分裝于1L 錐形瓶中，在搖床上震搖3h，使大孔樹脂吸附發(fā)酵液中的次生代謝產(chǎn)物。將大孔樹脂裝于玻璃柱中，用蒸餾水沖洗大孔樹脂至流出液無色。再用甲醇洗脫大孔樹脂至洗脫液無色，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮甲醇，最終得4.2g 黑褐色的粗浸膏。用20 mL 蒸餾水將粗浸膏超聲分散，使其成為均勻的顆粒狀懸浮液，然后依次用不同極性有機溶劑（石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）分別震蕩萃取5 次，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮各種極性的萃取液，得不同極性的粗浸膏。運用硅膠和凝膠柱層析、重結(jié)晶、HPLC等方法反復(fù)分離純化乙酸乙酯粗浸膏，得單體化合物1-6。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末。ESI-MS m/z:311[M+H]+，333 [M+Na]+。1H-NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:9.24(1H，br s，OH-7')，7.88(2H，br s，NH)，7.27(2H，t，J=7.5Hz，H-6，8)，7.20 (1H，d，J=6.9Hz，H-7)，7.03(2H，d，J=7.5 Hz，H-5，9)，6.83(2H，d，J=8.0 Hz，H-5'，9')，6.67 (2H，d，J=8.0 Hz，H-6'，8')，3.94 (1H，m，H-2')，3.89(1H，m，H-2)，2.61(2H，m，H-3a，3'a)，2.18 (2H，m，H-3b, 3'b)；13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:166.7(C-1)，166.5(C-1')，156.4(C-7')，136.5(C-4)，131.1(C-5'，9)，130.0(C-5，9)，128.2(C-6，8)，126.3(C-7，4')，115.1(C-6'，8')，55.9(C-2)，55.5(C-2')，39.4 (C-3')，38.7(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致，故鑒定該化合物為環(huán)(苯丙氨酸-酪氨酸)二肽[3]。藥理活性試驗表明該化合物對心血管系統(tǒng)起作用，可降低心率、冠脈血流量、左心室收縮壓和心臟傳導(dǎo)速率[4]。

化合物2：白色粉末。ESI-MS m/z:211[M+H]+，233[M+Na]+。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ:6.34(1H，br s，NH)，4.13 (1H，t，J=8.0Hz，H-2)，4.02 (1H，d，J=8.0 Hz, H-2')，3.56(2H，m，H-5)，2.35(1H，m，H-3a)，2.13(1H，m，H-3b，)，2.07(1H，m，H-3'a)，2.04(1H，m，H-4a)，1.91(1H，m，H-4'b)，1.77(1H，m，H-4')，1.53(1H，m，H-3'b)，1.00(3H，d，J=6.5 Hz，H-6')，0.95 (3H，d，J=6.5 Hz，H-5')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）二肽[5]。研究表明該化合物對tsFT210 小鼠乳腺癌細(xì)胞有弱的活性[6]。

化合物3：白色粉末。ESI-MS m/z:245[M+H]+，267[M+Na]+。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.36 (2H，d，J=7.0 Hz，H-6，8)，7.29 (1H，dd，J=7.0，6.5，Hz，H-7)，7.23(2H，d，J=7.5Hz，H-4，5)，5.70 (1H，br s，NH)，4.29(1H，dd，J=10.0，3.0 Hz，H-2')，4.08(1H，t，J=8.5 Hz，H-2)，3.54-3.67(3H，m，H-3'a，5'a，5'b)，2.78(1H，dd，J=14.0，10.5 Hz，H-3b)，2.38(1H，m，H-3a)，1.92-2.04(3H，m，H-3'b，4'a, 4'b)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致，故鑒定該化合物為環(huán)（苯丙氨酸-脯氨酸）二肽[7]。藥理活性試驗表明該化合物具有誘導(dǎo)生物發(fā)光的作用[8]。

化合物4：白色粉末。ESI-M m/z:261[M+H]+，283[M+Na]+。1H-NMR( MeOH-d4，500 MHz)δ:7.21-5.30(5H，m，H-5，6，7，8，9)，4.32(1H，t，J=4.5 Hz，H-2)，3.68(1H，dd，J=11.0，4.5 Hz，H-2')，3.30(1H, m，H -4')，2.95 (1H, dd，J =13.5，5.0 Hz，H -3a)，1.44(1H，m，H-3b)，0.88 (2H，m，H-3'a，3'b)，0.75 (3H，d，J=6.5 Hz，H-6')，0.70 (3H，d，J=6.5 Hz，H-5')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致，故鑒定該化合物為環(huán)（苯丙氨酸-亮氨酸）二肽[9]。該化合物可以被螞蟻用作進(jìn)攻或自衛(wèi)的武器[10]。

化合物5：白色晶體。ESI-M m/z:197[M+H]+，219[M+Na]+。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.84(1H，br s，NH)，4.09(1H，t，J=7.5 Hz，H-2')，3.95(1H，br s，H-2)，3.64 (1H，m，H-5'a)，3.56 (1H，m，H-5'b)，2.65(1H，m，H-3'a)，2.39 (1H，m，H-3'b)，2.06 (2H，m，H-4a，4'b)，1.92 (1H，m，H-3)，1.07 (3H，d，J=7.2Hz，H-4)，0.91(3H，d，J=6.8 Hz，H-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致，故鑒定該化合物為環(huán)（脯氨酸-纈氨酸）二肽[11]。藥理活性試驗表明該化合物具有抗鰻弧菌活性，MIC 為0.26nmol/mL[12]。

化合物6：白色針狀晶體。ESI-M m/z:139[M+H]+，161[M+Na]+。1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)δ:10.36(1H，br s，H-8)，7.90 (1H，dd，J=8.5，1.5 Hz，H-2)，7.54(1H，dd，J=7.5，1.5Hz，H-4)，7.01 (1H，dd，J=8.0，1.0 Hz，H-5)，6.96 (1H，dd，J=8.0，1.5 Hz，H-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致，故鑒定該化合物為鄰羥基苯甲酸[13]。藥理活性試驗表明該化合物有較好的抗真菌活性[14]。

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