趨化因子受體7聯(lián)合CT診斷膀胱移行細胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

謝文杰，祖雄兵，陳金波，崔宇，唐云華，李超，劉龍飛

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 泌尿外科，湖南 長沙 410008）

·臨床論著·

趨化因子受體7聯(lián)合CT診斷膀胱移行細胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

謝文杰，祖雄兵，陳金波，崔宇，唐云華，李超，劉龍飛

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 泌尿外科，湖南 長沙 410008）

目的研究膀胱移行細胞癌（BTCC）中趨化因子受體7（CCR7）的表達，并聯(lián)合CT診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。方法研究該院行根治性膀胱全切+盆腔淋巴結(jié)清掃的115例病例，術(shù)前行泌尿系及盆腔CT掃描，膀胱癌組織標本行CCR7免疫組織化學(xué)染色并記錄盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。運用統(tǒng)計學(xué)方法分析CCR7的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并比較分析CCR7、CT及CCR7聯(lián)合CT診斷膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性、特異性和精確度。結(jié)果BTCC組織中的CCR7表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）。多因素分析顯示CCR7的表達是膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立影響因子（P＜0.05）。采用CT診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性、特異性和精確度分別為52.4%、79.5%及69.6%，而CCR7聯(lián)合CT診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性、特異性和精確度分別為92.3%、83.6%及70.0%。結(jié)論CCR7是膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立影響因子，CCR7聯(lián)合CT可提高CT診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性。

CCR7；膀胱癌；CT；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

膀胱移行細胞癌（bladder transitional cell carcinoma，BTCC）是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，是當前泌尿外科醫(yī)師面臨的一大難題［1］。研究表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響膀胱癌患者預(yù)后的重要因素之一［2］。臨床上螺旋CT掃描廣泛應(yīng)用于膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷，但其敏感性并不令人滿意［3］。研究表明，血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）聯(lián)合CT可提高診斷膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性［4］。腫瘤趨化因子及其受體家族在腫瘤轉(zhuǎn)移方面有重要作用。趨化因子受體7（CCR7）廣泛表達于肺癌、胃癌、乳腺癌等組織中，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有重要關(guān)系［5］。本文通過免疫組織化學(xué)方法檢測BTCC組織中CCR7的表達，探討其是否能作為膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)測因子，并探討CCR7聯(lián)合CT診斷能否提高CT診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性。

1　資料與方法

1.1研究對象

選取中南大學(xué)湘雅醫(yī)院2009年1月-2012年12月住院行膀胱癌根治+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的115例BTCC組織，均經(jīng)病理證實。其中男62例，女53例；年齡40～78歲，平均61.5歲。所有患者術(shù)前均行泌尿系及盆腔CT掃描。膀胱腫瘤組織病理學(xué)分級采用WHO分級法：Ⅰ級14例，Ⅱ級42例，Ⅲ級59例。臨床分期采用UICC-TNM分期法：T1期7例，T2期26例，T3期58例，T4期24例。

1.2方法

將收集的115例膀胱移行細胞癌組織石蠟標本采用免疫組織化學(xué)染色法檢測CCR7的表達情況。分析術(shù)前CT判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，并記錄手術(shù)清掃的陽性淋巴結(jié)位置及數(shù)目。淋巴結(jié)清掃范圍如下：78例標準盆腔淋巴結(jié)清掃（上界為雙側(cè)髂總動脈分叉，下界為Cooper韌帶、股管人口處，外側(cè)界至生殖股神經(jīng)，內(nèi)側(cè)界達膀胱壁，包括雙側(cè)髂內(nèi)、髂外以及閉孔淋巴結(jié)）。37例因術(shù)前和術(shù)中評估疑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能，故行擴大淋巴結(jié)清掃（包括雙側(cè)盆腔髂血管周圍淋巴結(jié)、雙側(cè)髂總血管周圍淋巴結(jié)、骶前淋巴結(jié)、腹主動脈和下腔靜脈周圍淋巴結(jié)）。

免疫組織化學(xué)采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶連結(jié)SP（中山金橋生物公司，編號SP-9000）一步法進行，兔抗人CCR7多克隆抗體（美國Abcam公司，編號ab32527）1∶200稀釋作為一抗，PBS代替一抗作為陰性對照，已知乳腺癌組織切片染色作為陽性對照，按試劑盒說明書相關(guān)步驟操作，具體如下:①石蠟切片:收集的石蠟標本4μm連續(xù)切片，于65℃烤箱中烘烤30 min；②脫蠟水化:二甲苯I與二甲苯II依次脫蠟20 min，梯度酒精水化（100%乙醇5 min→95%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min），PBS沖洗5 min×3次；③抗原熱修復(fù)：將切片放入0.01 M枸椽酸緩沖液（pH 6.0）中95℃加熱15 min，自然冷卻至40℃，PBS沖洗5 min×3次；④滅活內(nèi)源性過氧化物酶:加入適量的3%過氧化氫，室溫孵育20 min，PBS沖洗5 min×3次；⑤加入正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育10 min，棄去多余液體；⑥滴加稀釋后的兔抗人CCR7多克隆抗體，40℃孵育過夜，PBS沖洗5 min×3次；⑦滴加生物素標記羊抗兔IgG，室溫孵育40 min，PBS沖洗5 min×3次；⑧滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育40min，PBS沖洗5min×3次；⑨DAB顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間，自來水洗終止顯色過程；⑩蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；11顯微鏡下觀察。

1.3結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)結(jié)果由2位獨立的病理醫(yī)生（無相關(guān)樣本臨床資料的信息）分析，出現(xiàn)結(jié)果不一致時重新判片，直至達成一致意見。在高倍鏡下隨機觀察3個視野，計數(shù)細胞總數(shù)，觀察結(jié)果采用二維半定量方法進行，即綜合考慮腫瘤細胞的染色陽性率和染色強度。染色陽性率的評分標準為:0分，無染色陽性細胞；1分，＜10%染色陽性細胞；2分，10% ～50%染色陽性細胞；3分，＞50%染色陽性細胞。染色強度評分標準:0分，無著色；1分，輕度著色（略強于陰性對照）；2分，中度著色（1～3分）；3分，重度著色（相當于或強于陽性對照）。將兩者評分相加后作為評定標準:0～1為Ⅰ，2為Ⅱ，3～4為Ⅲ，4～6為Ⅳ。

所有患者術(shù)前均行泌尿系及盆腔64位多層螺旋CT（德國西門子Somatom）掃描。掃描層厚為5mm。115例患者的CT片均通過電子系統(tǒng)調(diào)閱，并由2位獨立的泌尿外科醫(yī)師和放射科醫(yī)生完成，閱片評估前均不知曉患者淋巴結(jié)的病理結(jié)果。盆腔淋巴結(jié)＞10 mm作為陽性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的評判標準。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料用χ2檢驗，等級資料用秩和檢驗（Mann-Whitney U test），單因素分析用四格表計數(shù)分析，多因素分析用二分類Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1BTCC組織中CCR7的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

115例BTCC患者中，術(shù)后病理證實淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移陽性者為42例，淋巴結(jié)陰性者為73例。淋巴結(jié)陽性組中，CCR7的表達Ⅰ級0例，Ⅱ級5例，Ⅲ級14例，Ⅳ級23例。而淋巴結(jié)陰性組中，CCR7的表達Ⅰ級15例，Ⅱ級36例，Ⅲ級22例，IV級為0例。兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CCR7的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。見表1。

表1　BTCC組織中CCR7的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.2BTCC組織中CCR7的表達是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立影響因子

單因素分析顯示，在115例BTCC患者中，年齡、性別、腫瘤分期、分級、腫瘤大小、發(fā)病次數(shù)等6個臨床參數(shù)，僅腫瘤分期、分級與CCR7蛋白表達的陽性率之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他3項臨床參數(shù)與CCR7蛋白的表達并未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（P＞0.05）。多因素分析顯示，僅CCR7蛋白表達為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生的獨立影響因子（P＜0.001，＾OR= 2.93），CCR7蛋白高表達組發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險約為低表達組的3倍。見表2。

表2　淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與各臨床參數(shù)的單因素和多因素分析

2.3CCR7聯(lián)合CT診斷BTCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可提高CT診斷的敏感性

將CCR7的表達分為2組，Ⅰ、Ⅱ為低表達組陰性（-），Ⅲ、Ⅳ為高表達組陽性（+）。CCR7和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均（+）的有37例，CCR7（+）而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（-）的有22例，CCR7（-）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均（-）的有51例，CCR7（-）而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（+）的有5例。CCR7單獨評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性、特異性和精確度分別為88.1%、69.9%及76.5%。115例患者中，CT診斷淋巴結(jié)陽性的有37例，陽性率為32.2%（37/115）。其中，CT評估與淋巴結(jié)均（+）的有22例，CT（+）而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（-）的有15例，CT與淋巴結(jié)均（-）的有58例，CT（-）而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（+）的有20例。CT單獨評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性、特異性和精確度分別為52.4%、79.5%及69.6%。當CCR7聯(lián)合CT診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，敏感性、特異性和精確度分別為92.3%、83.6%及70.0%（100/115），見表3。

表3　CCR7、CT及CCR7聯(lián)合CT診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性、特異性和精確度

3　討論

膀胱癌是最見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均較高。據(jù)統(tǒng)計，2012年美國新發(fā)膀胱癌患者73 510例，病死人數(shù)達14 880例［6］。膀胱癌具有反復(fù)復(fù)發(fā)、局部浸潤以及遠處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征，如何監(jiān)測以及抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移，是目前膀胱癌研究的重點之一。研究表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響膀胱癌預(yù)后的重要因素，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者往往預(yù)后不佳［7］。

趨化因子及其受體家族在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。趨化因子受體7既往認為是孤兒受體，近期研究發(fā)現(xiàn)其配體為CCL12和CCL19。目前發(fā)現(xiàn)在許多癌組織中，如乳腺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌等均有較高表達［8］。并且高表達的CCR7是影響這些腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一項獨立影響因素［9］。YATES等［10］發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞中的CCR7表達促進癌細胞的增殖和侵襲的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。國內(nèi)學(xué)者侯愷林等［11］也發(fā)現(xiàn)，CCR7蛋白高表達與膀胱移行細胞癌的惡性程度及預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)陽性組與陰性組的CCR7表達差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），證實CCR7的表達與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的單因素分析顯示，腫瘤病理分級、臨床分期及CCR7蛋白表達是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素。進一步多因素回歸分析顯示，CCR7的表達是膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一項獨立影響因子（P＜0.05，＾OR= 2.93），CCR7蛋白高表達組發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險約為低表達組的3倍。由此推測可能是CCR7蛋白的高表達對腫瘤的分期與分級產(chǎn)生一定的影響，從而進一步影響淋巴結(jié)的陽性率。

CT掃描是診斷膀胱癌和評估分期的重要手段，然而其敏感性并不令人滿意。FICARRA等［12］研究發(fā)現(xiàn)，45例淋巴結(jié)陽性的膀胱癌患者，術(shù)前CT只診斷出了19例，敏感性為42.25%。一般認為CT顯示，直徑至少＞0.5 cm的淋巴結(jié)才考慮是陽性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)可能。本研究中，CT單獨評估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性、特異性和精確度分別為52.4%、79.5%及69.6%，說明CT診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的局限性，如何提高其診斷的敏感性尤為重要。CCR7單獨診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，敏感性、特異性和精確度分別為88.1%、69.9%及76.5%。CCR7診斷的敏感性高于CT，但特異性偏低。當CCR7聯(lián)合CT診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，敏感性、特異性和精確度分別為92.3%、83.6%及70.0%。因此，CCR7聯(lián)合CT診斷膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可提高其敏感性，彌補CT的不足。

CCR7是膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立影響因子，是預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可靠指標。CCR7聯(lián)合CT診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能提高CT診斷的敏感性，則可對盆腔淋巴結(jié)的清掃范圍提供更詳細的評估，同時對患者術(shù)后的化療也可能有一定的參考價值。

［1］KAUFMAN DS，SHIPLEY WU，F(xiàn)ELDMAN AS.Bladder cancer［J］. Lancet，2009，374（9685）:239-249.

［2］HERR HW.Superiority of ratio based lymph node staging for bladder cancer［J］.Urology，2003，169（3）:943-945.

［3］BALTACI S，RESORLU B，YAGCI C，et al.Computerized tomography for detecting perivesical infiltration and lymph node metastasis in invasive bladder carcinoma［J］.Urol Int，2008，81（4）: 399-402.

［4］LI Z，QI F，MIAO J，et al.Vascular endothelial growth factor-C associated with computed tomography used in the diagnosis of lymph node metastasis of bladder carcinoma［J］.Arch Med Res，2010，41（8）:606-610.

［5］CASSIER PA，TREILLEUX I，BACHELOT T，et al.Prognostic value of the expression of C-chemokine receptor 6 and 7 and their ligands in nonmetastatic breast cancer［J］.BMCCancer，2011，11:213.

［6］SIEGEL R，NAISHADHAM D，JEMAL A.Cancer statistics 2012［J］. CA Cancer J Clin，2012，62（1）:10-29.

［7］TURKOLMEZ K，TOKGOZ H，RESORLU B，et al.Muscle-invasive bladder cancer:predictive factors and prognostic difference between primary and progressive tumors［J］.Urology，2007，70（3）: 477-481.

［8］IRINO T，TAKEUCHI H，MATSUDA S，et al.CC-Chemokine receptor CCR7:a key molecule for lymph node metastasis in esophageal squamous cell carcinoma［J］.BMC Cancer，2014，14: 291.

［9］ZHOU S，SHEN Z，WANG Y，et al.CCR7 expression and intratumoral FOXP3+regulatory T cells are correlated with overall survival and lymph node metastasis in gastric cancer［J］.PLoS One，2013，8（9）:e74430.

［10］YATES TJ，KNAPP J，GOSALBEZ M，et al.C-X-C chemokine receptor 7:a functionally associated molecular marker for bladder cancer［J］.Cancer，2013，119（1）:61-71.

［11］侯愷林，張連華，薄雋杰，等.趨化因子受體7在膀胱癌組織中的表達及其臨床意義［J］.中華泌尿外科雜志，2011，32（1）:42-46.

［12］FICARRA V，DALPIAZ O，ALRABI N，et al.Correlation between clinical and pathological staging in a series of radical cystectomies for bladder carcinoma［J］.BJU Int，2005，95（6）:786 -790.

（張西倩 編輯）

Chemokine receptor CCR7 as a predictive biomarker associated with computed tomography in diagnosing lymph node metastasis of bladder carcinoma

Wen-jie XIE，Xiong-bing ZU，Jin-bo CHEN，Yu CUI，Yun-hua TANG，Chao LI，Long-fei LIU
（Department of Urology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008，P.R.China）

【Objective】To determine whether chemokine receptor CCR7 expression combined with computed tomography（CT）has a relationship with lymph node metastasis in bladder transitional cell carcinoma （BTCC）.【Methods】Totally 115 BTCC cases were studied in our department.Preoperative CT scans of abdomen and pelvis，CCR7 immunohistochemical expression in tumor specimens and pathological findings for lymph node metastasis were assessed.The sensitivity，specificity and accuracy of CCR7，CT and their combination in diagnosis of lymph node metastasis of BTCC were evaluated.【Results】The CCR7 expression in BTCC was correlated with lymph node metastasis（P＜0.05）.Multivariate analysis indicated that CCR7 expression was an independent predictor for lymph node metastasis in BTCC（P＜0.05）.The sensitivity，specificity and accuracy of CCR7 combined with CT scan in the diagnosis of lymph node metastasis of BTCC were 92.3%，83.6%and 70.0%，respectively；those of CT alone were 52.4%，79.5%and 69.6%，respectively. 【Conclusions】CCR7 is an independent indicator for lymph node metastasis of BTCC.CCR7 combined with CT can improve the sensitivity of CT in diagnosing lymph node metastasis in BTCC.

CCR7；bladder carcinoma；computed tomography；lymph node metastasis

R737.14

A

1005-8982（2015）33-0032-04

2015-05-24

祖雄兵，E-mail：whzuxb@163.com