肝癌中過氧化物酶-1的表達及臨床意義

涂青松，何剪太2（中南大學湘雅醫(yī)院 .腫瘤科，2.普外科，湖南 長沙 40008）

肝癌中過氧化物酶-1的表達及臨床意義

涂青松1，何剪太2
（中南大學湘雅醫(yī)院 1.腫瘤科，2.普外科，湖南 長沙 410008）

目的探討過氧化物酶-1（Prx-1）在肝癌中的表達，并評估其在肝癌診療中的臨床價值。方法采用免疫組織化學方法檢測患者肝癌組織和癌旁組織中Prx-1的表達。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清Prx-1水平。結(jié)果免疫組織化學結(jié)果表明，Prx-1在肝癌組織中的陽性表達率為75.4%，高于癌旁組織（36.8%）（P＜0.05）。Prx-1表達與腫瘤組織中的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、微血管密度（MVD）呈正相關(guān)。ELISA結(jié)果表明，與健康對照志愿者比較，肝癌患者血清Prx-1水平更高［（31.2±13.5）ng/ml vs（13.2±11.9）ng/ml，P=0.000）］。Prx-1表達與惡性臨床病理參數(shù)有相關(guān)性。血清Prx-1與AFP結(jié)合時，曲線下面積（AUC）明顯高于單獨Prx-1。陽性Prx-1表達與不良總生存期（OS）及無病存活率（DFS）有相關(guān)性（P=0.002和0.000）。多變量分析表明，Prx-1染色是不良OS及DFS的獨立生物標記物（P=0.035和0.000）。結(jié)論肝癌患者Prx-1表達水平顯著升高，Prx-1表達上調(diào)與腫瘤血管生成密切相關(guān)，有望成為肝癌診斷和預后的標記物。

肝癌；過氧化物酶-1；免疫組織化學；血管內(nèi)皮生長因子

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年死于肝癌的人數(shù)達37萬［1-2］。由于肝癌早期癥狀隱匿，難以早期診斷且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，使肝癌患者預后差，致死率高居不下。若不對肝癌患者采取治療措施，5年存活率＜5%［3-4］。雖然肝癌治療已取得一定程度的進展，但是肝癌患者5年期存活率仍＜5%［5］?；颊哳A后不良的主要原因是80%肝癌患者確診時已處于晚期，且由于局部浸潤和遠端轉(zhuǎn)移，失去根治性手術(shù)機會［6］。因此，尋找肝癌早期診斷和臨床愈后的標記物已成為當務(wù)之急。

過氧化物酶-1（Peroxiredoxin-1，Prx-1）屬于巰基特異性抗氧化蛋白家族成員，可調(diào)節(jié)過氧化氫水平，介導信號轉(zhuǎn)導通路［7］。Prx-1參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生物功能的調(diào)節(jié)［8］。近年來研究表明，Prx-1在乳腺、肺、泌尿系統(tǒng)和胃癌等人類腫瘤中過表達［9-16］。

SHEN等［17］通過二維凝膠電泳和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，肝癌中Prx-1表達上調(diào)。但是Prx-1表達上調(diào)對肝癌的臨床意義尚不清晰。因此，本實驗采用免疫組織化學法分析114例患者肝癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中Prx-1的表達，另外還檢測肝癌組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和CD31的表達；并分析Prx-1表達與VEGF、微血管密度（microvessel density，MVD）、臨床病理特征及患者存活率的相關(guān)性。使用酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測患者血清中Prx-1含量，探討患者術(shù)前血清Prx-1水平與臨床病理特征的相關(guān)性，評估Prx-1在肝癌篩查中的作用價值。

1　資料與方法

1.1研究對象

選取2010年1月-2010年12月湖南省腫瘤醫(yī)院的肝癌病例，114例肝癌組織標本。所有患者行手術(shù)治療，手術(shù)前未行放射及化學藥物治療，經(jīng)病理確診為肝癌，患者年齡29～63歲，中位年齡（48± 2.1）歲。114例肝癌患者中，年齡≥60歲49例，＜60 歲65例；腫塊直徑＜2 cm患者65例，≥2 cm患者49例；肝癌組織學分級標準參照肝和肝內(nèi)膽管腫瘤組織學分類（世界衛(wèi)生組織2000年標準），組織學分級：G1級21例，G2級39例，G3級54例；肝癌分期標準參照2002年版美國癌癥聯(lián)合委員會（Amercian Joint Committee on cancer，AJCC）標準，TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期72例，Ⅲ、Ⅳ期42例；所有患者中伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例。所有患者接受定期隨訪，直至死亡或隨訪結(jié)束（2014年12月）。評價隨訪期為33.6個月（6～42個月）?；颊叨ㄆ诮邮苌眢w檢查、超聲檢查，如有必要進行CT掃描?？偵嫫冢╫verall survival，OS）是指手術(shù)至死亡的間隔時間。

1.2免疫組織化學法

免疫組織化學法染色檢測肝癌及其相應(yīng)癌旁組織中Prx-1、VEGF及CD34的表達。切取癌組織、癌旁組織及正常組織，福爾馬林固定24 h，酒精逐級脫水，石蠟包埋，然后制成組織切片，脫臘至水，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）振洗3 min×3；3%過氧化氫封閉30 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，防止非特異性染色，PBS振洗3 min× 3；3 mol/L尿素消化30 min，充分暴露抗體，檸檬酸修復，PBS振洗3 min×3；用濾紙擦干后置于濕盒內(nèi)，37℃正常血清封閉30 min；滴加3μg/ml一抗，置于4℃冰箱過夜；第2天將切片取出后37℃復溫30 min，PBS振洗3 min×3；滴加二抗，37℃濕盒內(nèi)孵育30min，PBS振洗3 min×3；滴加親和素-生物素-過氧化物酶復合物（avidin-biotin-peroxidase complex technique，ABC），37℃濕盒內(nèi)孵育30 min，PBS振洗3min×3；二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色20 min，自來水充分沖洗，蘇木素淡染，酒精逐級脫水、透明、封片。

1.3結(jié)果判定

采用雙盲法觀察陽性結(jié)果。所有免疫組織化學染色結(jié)果經(jīng)過湖南省腫瘤醫(yī)院兩位病理科副教授獨立判定。Prx-1陽性定位于肝癌組織中的細胞核，陽性染色成棕黃色，光鏡下每張切片中選取癌細胞較多的5個高倍視野（×200），每個視野計數(shù)100個細胞。細胞核呈棕黃色至棕黑色細胞數(shù)＞10%為陽性（+），≤10%或無著色為陰性（-）。CD34和VEGF以細胞質(zhì)和/或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。高倍鏡觀察5個視野，判斷標準：棕黃色細胞＞5%為陽性（+），≤5%或無著色為陰性（-）。

1.4ELISA法

采用ELISA法檢測肝癌患者血清中Prx-1含量，試劑盒購自美國R&D公司，按試劑盒說明書進行操作。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，用t檢驗或單因素方差分析，計數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗和Spear man相關(guān)檢驗分析免疫組織化學結(jié)果。使用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析、評估血清Prx-1、CA19-9及聯(lián)合診斷肝癌的潛力。使用卡普蘭Meier法繪制生存曲線，存活率的比較用對數(shù)秩檢驗。使用Cox回歸模型確定術(shù)后肝癌患者獨立預后因素。所有檢驗為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1Prx-1和VEGF在肝癌組織中的表達

免疫組織化學結(jié)果顯示，不同染色強度的Prx-1局部存在于肝癌細胞細胞質(zhì)中（見圖1）。與相鄰的非肝癌組織比較（42/114，36.8%），肝癌組織Prx-1 （86/114，75.4%）陽性率顯著升高（P=0.027）。

114例樣本中，75例肝癌組織細胞質(zhì)中存在VEGF陽性表達（65.8%）（見圖1）。Spearman秩相關(guān)檢驗表明，腫瘤組織中Prx-1與VEGF的表達呈正相關(guān)（r=0.315，P=0.003），見表1。

2.2肝癌組織中Prx-1表達與MVD的相關(guān)性

CD34染色結(jié)果提示，平均MVD為13.9（2～37）（見圖1）。Prx-1陽性表達的肝癌組織MVD明顯高于 Prx-1陰性表達的肝癌組織 ［（14.9±7.7）vs （10.9±7.0），P=0.016）］。MVD≥均值認為是高MVD，而MVD＜均值認為是低MVD。Spearman秩相關(guān)檢驗也顯示，Prx-1表達與腫瘤組織MVD呈正相關(guān)（r=0.241，P=0.026）（見表1）。

圖1　Prx-1、VEGF及CD34在肝癌組織中的表達（×200）

2.3Prx-1表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Prx-1表達與組織學分級、神經(jīng)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血清CA19-9及TNM分期有相關(guān)性（P=0.016、 0.004、0.007、0.025和0.003）。而Prx-1表達與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑無相關(guān)。見表2。

表1　Prx-1表達與VEGF、MVD的相關(guān)性　例

圖2　血清Prx-1、AFP及Prx-1聯(lián)合AFP診斷肝癌的ROC曲線

2.4肝癌患者血清Prx-1含量

ELISA結(jié)果提示，肝癌患者血清Prx-1水平高于正常志愿者（31.2±13.5）ng/ml vs（13.2±11.9）ng/ml，P=0.000）。并且晚期肝癌患者血清Prx-1水平更高（見表2）。本研究還通過繪制ROC曲線評估血清Prx-1在肝癌診斷中的準確性和可靠性。血清Prx-1水平可區(qū)分出健康志愿者和肝癌患者 ［曲線下面積（area under curve，AUC）=0.839，（95%CI：0.754和0.923）］（見圖2）。與血清甲胎蛋白（alpha-fetal pro-tein，AFP）聯(lián)合檢測能提高血清Prx-1診斷肝癌的能力，［AUC=0.913，（95%CI：0.863和0.963）］。

表2　臨床病理參數(shù)與Prx-1表達的相關(guān)性

2.5生存分析

采用卡普蘭Meier曲線法分析Prx-1表達對患者OS和無病生存期（Disease-freesurvival，DFS）的影響，結(jié)果表明，Prx-1陽性表達肝癌患者OS明顯較Prx-1陰性表達短（11個月vs 28個月，P=0.002）。Prx-1陽性表達肝癌患者DFS明顯較Prx-1陰性表達短（6個月vs 21個月，P=0.001）。見圖3。

單因素分析提示，Prx-1表達、組織學分級、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血清AFP及TNM分期對OS和DFS的預后影響較大，見表3。多變量生存分析進一步表明，腫瘤Prx-1陽性是肝癌患者OS及DFS不良預后的標記物［HR1=3.126，（95%CI1：1.425和7.018），P1=0.035；HR2=4.805，（95%CI2：2.136和10.812），=0.000］。另外，組織學分級、血清AFP及TNM分期也是OS和DFS的獨立預測物。見表4。

圖3　卡普蘭Meier曲線分析Prx-1表達對肝癌患者OS和DFS表達的影響

表3　單因素影響肝癌患者OS和DFS的預后因素

續(xù)表3

表4　多因素分析影響肝癌患者OS 和DFS的預后因素

3　討論

有研究發(fā)現(xiàn)，Prx-1在肺癌、胃癌、結(jié)腸癌及宮頸癌等多種人類腫瘤中異常高表達［9-14］。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Prx-1表達明顯高于相應(yīng)癌旁組織，與以往研究結(jié)果一致［17］。另外本研究發(fā)現(xiàn)，與健康受試者比較，肝癌患者血清Prx-1含量顯著升高，提示血清Prx-1可成為早期診斷肝癌的有效血清標記物。盡管AFP、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、凝血酶原、血清巖藻糖苷酶和酸性鐵蛋白等多種血清標記物可用于肝癌診斷，但單獨使用時，這些標志物的敏感性和特異性較低［18-20］。聯(lián)合使用肝癌標記物可顯著提高肝癌診斷的敏感性和特異性［21］。

肺癌的研究證實血清Prx-1含量在腫瘤診斷中價值［22］。宮頸癌中Prx-1也有診斷意義，其與血清CA125聯(lián)合使用時可提高宮頸癌的診斷效能［14］。因此，本研究試圖探討Prx-1在肝癌診斷中的價值。結(jié)果表明，根據(jù)ROC曲線的AUC值，血清Prx-1與AFP診斷肝癌的特異性和敏感性比較差異無統(tǒng)計學意義。血清Prx-1和CA19-9聯(lián)合使用時，AUC值顯著高于兩者單獨使用，提示血清Prx-1與其他腫瘤標記物聯(lián)合使用能夠進行有效的肝癌早期篩查。

越來越多的證據(jù)表明，Prx-1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用［23-24］。REN等［23］報道，作為腫瘤相關(guān)抗原，Prx-1可促進食管鱗狀細胞癌惡性轉(zhuǎn)化。HA等［24］研究揭示，癌變細胞中，過量表達Prx-1通過誘導轉(zhuǎn)變生長因子β1，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）。EMT被認為是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的重要環(huán)節(jié)。EMT過程中，由于惡性腫瘤細胞失去其上皮細胞特征，獲得間充質(zhì)細胞特征，惡性腫瘤可迅速發(fā)展［25］。肝癌的迅速進展取決于增強細胞外基質(zhì)降解的獨特腫瘤微環(huán)境因素［26］，而且EMT也是腫瘤微環(huán)境的重要事件。腫瘤微環(huán)境的不同成分為EMT提供穩(wěn)定條件［27-28］。本研究結(jié)果表明，Prx-1上調(diào)與肝癌惡性生物特性相關(guān)。該結(jié)果充分證實，Prx-1在肝癌進展中具有重要作用，其可能是腫瘤微環(huán)境的重要成分之一，可能介導肝癌中EMT表型轉(zhuǎn)化過程。Prx-1參與EMT的調(diào)節(jié)機制，其在腫瘤微環(huán)境中的特異作用仍需進一步深入研究。

目前普遍認為，腫瘤血管形成在惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起至關(guān)重要的作用［29-30］。如MVD過程中，血管生成與肝癌及其他惡性腫瘤的進展和不良預后有相關(guān)性［31-33］。VEGF是促血管生成的特異性生長因子，被認為是腫瘤血管生成中的重要調(diào)節(jié)物［34-35］。以往研究表明，在乙型肝炎病毒相關(guān)肝細胞癌和胃癌中，VEGF與MVD有相關(guān)性［36-37］。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中Prx-1表達與VEGF和MVD呈負相關(guān)，揭示其促進腫瘤血管生成的作用可能涉及VEGF介導的腫瘤血管生成。目前證實在前列腺癌和肺癌中，Prx-1可誘導VEGF獨立性腫瘤血管生成［11-12，14］。但是Prx-1在肝癌腫瘤血管生成中的具體作用機制尚不明確，仍需進一步深入研究。

少數(shù)研究證實不同類型腫瘤中Prx-1表達的診斷意義。如KIM［38-39］和YONGLITTHIPAGON等［40］的研究表明，在術(shù)后肺癌患者中，Prx-1是提示腫瘤復發(fā)、降低存活率的獨立預測指標。LI等［41］研究提示，陽性Prx-1表達與OS降低相關(guān)，且在膽囊癌患者中可作為獨立不良預后因素。HAAPASALO等［42］報道，Prx-1表達與較短的存活率相關(guān)，可能在室管膜瘤中起預后生物標記物作用。本研究結(jié)果提示，陽性Prx -1表現(xiàn)出不良OS和DFS，可作為不良預后的獨立標記物。高Prx-1對患者預后有副作用，間接表明其基因在促進肝癌的進展中起積極作用。但是也有不同的研究結(jié)果，有研究發(fā)現(xiàn)，Prx-1是陽性雌激素受體乳腺癌中良好預后的獨立標記物［43］。因此，本研究結(jié)果需更大樣本量的研究證實。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Prx-1在肝癌組織及肝癌患者血清中表達升高。Prx-1上調(diào)與腫瘤血管生成、肝癌進展密切相關(guān)。血清Prx-1聯(lián)合血清AFP可提高肝癌診斷能力。術(shù)后患者Prx-1陽性表達可作為不良OS和DFS的獨立生物標記物。該發(fā)現(xiàn)為進一步探討肝癌中Prx-1異常高表達的生物相關(guān)性提供基礎(chǔ)。

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（張蕾 編輯）

Expression of peroxiredoxin-1 in patients with hepatocellular carcinoma and its clinical value

Qing-song TU1，Jian-tai HE2
（1.Department of Oncology，2.Department of General Surgery，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008，P.R.China）

【Objective】To investigate the expression of peroxiredoxin-1（Prx-1）in hepatocellular carcinoma and evaluate its clinical value.【Methods】Immunohistochemistry was used to detect Prx-1 expression in hepatocellular carcinoma tissues and paracancerous tissues.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）was applied to detect the serum Prx-1 level.【Results】The immunohistochemical results indicated that the positive rate of Prx-1 was higher in hepatocellular carcinoma tissues（75.4%）than in paracancerous tissues（36.8%，P ＜0.05）.Prx-1 expression was positively correlated with vascular endothelial growth factor（VEGF）and microvessel density（MVD）in the cancer tissues.The ELISA results showed that the patients with hepatocellular carcinoma had a higher serum Prx-1 level than the healthy subjects［（31.2±13.5）ng/ml vs（13.2±11.9）ng/ ml，P=0.000）.Prx-1 expression was correlated with aggressive clinicopathological parameter.The area under the curve（AUC）of the combination of serum Prx-1 and AFP was significantly larger than that of Prx-1 alone.Positive Prx-1 expression was correlated with disappointing overall survival（OS）（P=0.002）and disease-free survival（DFS）（P=0.000）.Multivariate analysis showed that Prx-1 staining was an independent biomarker of poor OS（P=0.035）and DFS（P=0.000）.【Conclusions】The level of Prx-1 expression is significantly increased in hepatocellular carcinoma.The up-regulated Prx-1 is closely related to tumor angiogenesis and acts as a promising tumor marker for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma.

peroxiredoxin-1；hepatocellular carcinoma；immunohistochemistry；vascular endothelial growth factor

R735.7

A

1005-8982（2015）33-0008-07

2015-08-13

何剪太，E-mail：hejiantai_cs@163.com