馬鬃嶺春季植物根際真菌多樣性研究

沈萬(wàn)芳

(安徽省黃山風(fēng)景區(qū)管委會(huì)園林局，安徽黃山 245800)

植物根際是受植物活根影響的土壤微區(qū)，是土壤微生物活動(dòng)的重要場(chǎng)所之一［1－2］。在植物根際聚居著數(shù)量巨大、種類(lèi)繁多的微生物，主要包括細(xì)菌、放線菌、真菌、線蟲(chóng)和原生動(dòng)物等，但這些微生物在環(huán)境中的功能目前仍了解很少，大部分根際過(guò)程的微生物學(xué)機(jī)理尚不清楚。目前植物根際微生物的研究重點(diǎn)多放在細(xì)菌上，對(duì)根際真菌的研究較少。昆蟲(chóng)病原真菌廣泛分布于不同的生態(tài)環(huán)境中，不但可以寄生昆蟲(chóng)，而且也能在不同的生境中營(yíng)腐生生活，并且具有豐富的遺傳異質(zhì)性［3］。目前已有昆蟲(chóng)病原真菌在植物根際和根內(nèi)定殖的研究報(bào)道。例如，綠僵菌可以在土壤中兼性腐生，維持其種群數(shù)量，從而起到持續(xù)防控害蟲(chóng)的作用，且植物根圍和根際土壤中宿存動(dòng)態(tài)的變化是有差異的［4－5］。Liao等［6］研究了羅伯茨綠僵菌(Metarhizium robertsii)作為根際微生物促進(jìn)了植物對(duì)氮的吸收并增強(qiáng)了植物抗病性。且有研究認(rèn)為昆蟲(chóng)病原真菌在植物根際定殖不是隨機(jī)的，是有嚴(yán)格的相關(guān)性［7］。

昆蟲(chóng)病原真菌殺蟲(chóng)劑已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)防治，如祝明亮等［8］研究了淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)在烤煙根際的定殖情況，發(fā)現(xiàn)如淡紫擬青霉是習(xí)居土壤的機(jī)會(huì)真菌，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne spp.)和胞囊線蟲(chóng)(Heterodera spp.)的卵有很強(qiáng)的寄生能力。根際昆蟲(chóng)病原真菌除了可以實(shí)現(xiàn)地下害蟲(chóng)生物防治以外，也有不少關(guān)于根際昆蟲(chóng)病原真菌防治植物病害報(bào)道，如Renwick等［9］通過(guò)室內(nèi)生測(cè)和小麥盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離自小麥根際的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)能有效持續(xù)控制小麥全蝕病菌(Gaeumannomyces graminis)。有些昆蟲(chóng)病原真菌定殖植物根際后具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)等特殊功能，如Liao等［8］報(bào)道羅伯茨綠僵菌寄生昆蟲(chóng)后，可將從昆蟲(chóng)中吸收的氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳給植物，還可分泌各種有機(jī)酸溶解土壤中的固態(tài)磷和二氧化碳［10］，且可以消除土壤中的鉛污染，并能幫助植物吸收土壤中的鐵和鋅［11］。但昆蟲(chóng)病原真菌用于生物防治往往受到防效不穩(wěn)定的困擾，其原因不僅是因?yàn)橐巴猸h(huán)境條件復(fù)雜，可能還與生防菌株在環(huán)境中包括土壤中存活的動(dòng)態(tài)變化、與寄主植物之間的存活關(guān)系不明有關(guān)。作為生防因子的生防菌株能否在靶植物根際定殖生長(zhǎng)及其對(duì)植株根際土壤微生物區(qū)系的抑制作用的強(qiáng)弱已成為篩選、評(píng)定土壤害蟲(chóng)生防菌株的一個(gè)重要指標(biāo)［8］。研究昆蟲(chóng)病原菌與植物的相關(guān)性及在植物根際定殖情況，不僅具有重要的理論意義，而且對(duì)于保護(hù)和促進(jìn)病原真菌在植物根際中的自我維持、更合理地利用真菌控制農(nóng)林業(yè)地下害蟲(chóng)也有重要的實(shí)踐意義。為此，筆者研究了安徽省六安市馬鬃嶺自然保護(hù)區(qū)春季不同植物根際昆蟲(chóng)病原真菌的物種多樣性及分布情況，旨在為昆蟲(chóng)病原真菌殺蟲(chóng)劑研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基 選擇性培養(yǎng)基:馬鈴薯200.00 g(削皮切碎后煮沸20 min 左右，過(guò)濾)、葡萄糖 20.00 g、放線菌酮 0.20 g、氯霉素0.20 g、多果定0.50 g、結(jié)晶紫0.01 g、瓊脂20.00 g，水1 000.00 g。SDAY 培養(yǎng)基:葡萄糖 20.00 g、蛋白胨 10.00 g、酵母浸出粉 10.00 g、瓊脂 20.00 g，水 1 000.00 g。

1.2 試驗(yàn)地概況 馬鬃嶺位于安徽省六安市金寨縣南部，境內(nèi)總面積為4 843.33 hm2。該地區(qū)氣候溫和，雨量充沛，日照充足，無(wú)霜期長(zhǎng)，自然條件優(yōu)越，植被資源極其豐富，是一座原始、古老、完美的綠色寶庫(kù)。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集。于2015年3月選取健康、生長(zhǎng)較旺盛的植株，去除根系表層土壤和雜物。采集草本植物根際土壤時(shí)將其整個(gè)植株連根挖出，去除根上附著的大土塊，用毛刷將根上粘著的細(xì)土抖落，然后將植物根放入無(wú)菌袋，封口，貼上標(biāo)簽。灌木或喬木采用鏟子采集植物根系(須根)，抖落大塊土壤，收集根系帶回實(shí)驗(yàn)室置于4℃冰箱保存，共采集植物根系樣品20份。其中，草本植物含有細(xì)葉麥冬、野薔薇、紫背天葵、云臺(tái)南星、鐵線蕨、早熟禾、蛇莓、白葉莓、虎耳草、大薊、腎蕨、箬竹、絡(luò)石、常春藤、天葵;灌木含有胡頹子、中華石楠、山胡椒、茶樹(shù);喬木有杉木。

1.3.2 植物根際真菌的分離和培養(yǎng)。①依次稱(chēng)取每種植物的根系1.00 g，用無(wú)菌水沖洗植物根系去除表面大顆土粒，緊貼在根系的土壤可保留;②將清洗干凈的植物根系剪成0.5 cm的小段，放入100 ml雙蒸水中振蕩搖勻;③取100 μl溶液接種于選擇性培養(yǎng)基上，每個(gè)植物根系重復(fù)3次;④將接種的平皿置于27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d左右，檢查培養(yǎng)皿中菌落生長(zhǎng)情況。根據(jù)培養(yǎng)皿內(nèi)菌落的形態(tài)、大小、色澤和生長(zhǎng)速度等特點(diǎn)從每個(gè)樣品中盡可能多地挑選單菌落，轉(zhuǎn)入SDAY培養(yǎng)基劃線，純化，保存。

1.3.3 植物根際真菌的鑒定。對(duì)分離純化的菌株培養(yǎng)6～12 d后，依據(jù)菌落培養(yǎng)性狀和培養(yǎng)特征對(duì)菌落進(jìn)行歸類(lèi)并統(tǒng)計(jì)數(shù)量，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行顯微形態(tài)觀察，記載菌絲、孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征，參照相關(guān)真菌分類(lèi)文獻(xiàn)［12］進(jìn)行真菌形態(tài)鑒定，明確其分類(lèi)地位，并用顯微攝像儀拍照已鑒定的真菌形態(tài)。對(duì)于形態(tài)鑒定困難的菌株，需借助分子生物學(xué)手段進(jìn)一步鑒定。

1.3.4 植物根際真菌菌落的計(jì)數(shù)。培養(yǎng)規(guī)定天數(shù)后，采用稀釋平板法統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量。雖然該研究采用的是針對(duì)分離培養(yǎng)昆蟲(chóng)病原真菌的選擇性培養(yǎng)基，但培養(yǎng)基也不能滿(mǎn)足所有昆蟲(chóng)病原真菌的生長(zhǎng)需求，所以得到的數(shù)據(jù)不能完全準(zhǔn)確地表現(xiàn)出土壤中昆蟲(chóng)病原真菌的實(shí)際數(shù)量，但是可以作為相對(duì)數(shù)值來(lái)反映根際昆蟲(chóng)病原真菌的數(shù)量及其分布規(guī)律［13］。

每克根系中菌落數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/根系質(zhì)量(g)1.3.5 菌種的保存。將純化培養(yǎng)的真菌接種到滅菌的甘油水溶液(甘油占5%，無(wú)菌水占95%)中，移至4℃冰箱中保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 春季馬鬃嶺植物根際昆蟲(chóng)病原真菌的數(shù)量分析 由圖1可知，20種植物根際的昆蟲(chóng)病原真菌數(shù)量表現(xiàn)出一定的差異。真菌菌落數(shù)量從高到低順序?yàn)樘炜?、虎耳草、箬竹、常春藤、鐵線蕨、中華石楠、白葉莓、野薔薇、云臺(tái)南星、絡(luò)石、紫背天葵、早熟禾、山胡椒、蛇莓、細(xì)葉麥冬、杉木、大薊、胡頹子、茶樹(shù)和腎蕨。其中，天葵根際昆蟲(chóng)病原真菌數(shù)量最高，為3.7×104cfu/g;而腎蕨根際昆蟲(chóng)病原真菌含量最低，未分離出菌落。分離到的昆蟲(chóng)病原真菌種類(lèi)數(shù)量的變化趨勢(shì)與菌落數(shù)量相似。野薔薇和天葵根際昆蟲(chóng)病原菌種類(lèi)最多，為7種，腎蕨根際未分離到真菌。由此可見(jiàn)，不同植物根際昆蟲(chóng)病原真菌種群數(shù)量差異較大。

2.2 春季馬鬃嶺植物根際昆蟲(chóng)病原真菌的科屬分析 通過(guò)對(duì)馬鬃嶺自然保護(hù)區(qū)15種草本植物、4種灌木和1種喬木根系采集，利用選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，共分離得到昆蟲(chóng)病原真菌306株，根據(jù)菌落形態(tài)、質(zhì)地、顏色等宏觀形態(tài)及顯微形態(tài)特征(圖2)，初步歸為2科7屬15個(gè)種。其中12個(gè)種為已知種，3個(gè)為未定種。2科分別為半知菌類(lèi)的叢梗孢科和瘤座孢科。7屬分別為棒束孢屬、白僵菌屬、綠僵菌屬、紫孢菌屬、普可尼亞屬、輪枝孢屬和Simplicillium。從梗孢科種類(lèi)最多，共4屬12種，占全部種類(lèi)的79.99%。從表1可知，棒束孢屬、白僵菌屬和綠僵菌屬為優(yōu)勢(shì)屬，含11種，占春季馬鬃嶺自然保護(hù)區(qū)植物根際昆蟲(chóng)病原真菌的73.32%。其他4屬都只有1種，種數(shù)占26.68%?？梢?jiàn)，春季馬鬃嶺自然保護(hù)區(qū)不同植物根際昆蟲(chóng)病原真菌優(yōu)勢(shì)屬種現(xiàn)象明顯。

圖1 不同植物根際昆蟲(chóng)病原真菌菌株數(shù)量和種類(lèi)統(tǒng)計(jì)

表1 馬鬃嶺植物根際昆蟲(chóng)病原菌科、屬統(tǒng)計(jì)

2.3 春季馬鬃嶺植物根際昆蟲(chóng)病原真菌的種類(lèi)分布 春季馬鬃嶺自然保護(hù)區(qū)植物根際昆蟲(chóng)病原真菌的分離比率為95%，20種植物中僅腎蕨沒(méi)有分離到昆蟲(chóng)病原真菌，且菌株數(shù)量和菌種都較豐富。分離出了球孢白僵菌、綠僵菌屬、環(huán)鏈棒束孢、玫煙色棒束孢、粉棒束孢、爪哇棒束孢、輪枝孢等昆蟲(chóng)病原真菌。其中以白僵菌屬真菌分布最廣泛且菌株數(shù)量大，20種植物根際中有17種植物分離出白僵菌，且所得菌落數(shù)量較大?？梢?jiàn)，白僵菌屬真菌是該區(qū)域春季植物根系優(yōu)勢(shì)真菌，其次是玫煙色棒束孢和淡紫紫孢菌。布氏白僵菌和普可尼亞屬真菌都僅有1種植物根際分離到，分離比率僅為5%(表2)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，安徽省六安市馬鬃嶺自然保護(hù)區(qū)植物根際昆蟲(chóng)病原真菌物種多樣性較豐富，共分離出2科7屬15個(gè)種，以球孢白僵菌數(shù)量最多，其次是玫煙色棒束孢和淡紫紫孢菌。研究發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)昆蟲(chóng)和病原體大部分相互作用的位置是寄主植物根際，意味著植物根際在將來(lái)可以被考慮作為篩選真菌菌株的載體，同時(shí)也提高了利用根際微生物進(jìn)行害蟲(chóng)防治的可能性，增加了利用昆蟲(chóng)病原真菌對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行保護(hù)的新領(lǐng)域。

圖2 部分分離菌株的菌落性狀與顯微觀察

表2 春季馬鬃嶺植物根際昆蟲(chóng)病原真菌種類(lèi)及分布

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