芽孢桿菌脂肽類抗生素的研究進展

熊漢琴等

摘要：脂肽類抗生素是芽孢桿菌產(chǎn)生的一類天然農(nóng)用抗生素，具有廣譜、高效、安全無毒、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，在芽孢桿菌生物防治方面發(fā)揮著重要作用。綜述了目前國內(nèi)外對脂肽類抗生素研究所取得的重要進展，包括脂肽類抗生素的種類和特性、快速分離鑒定、純品制備、基因改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化等，并對脂肽類抗生素的研究前景進行了展望。

關(guān)鍵詞：脂肽類抗生素；分離；鑒定；純化；發(fā)酵

中圖分類號：Q939.92 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-2817-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.001

Advances of Lipopeptides in Bacillus

XIONG Han-qin， CAI Yan-fei， GUO Zhen-zhen， ZHANG Ya-ya， CAO Yu

（South China Agricultural University， College of resources and enviroment， Guangzhou 510642， China）

Abstract：The lipopeptide from Bacillus is a kind of natural agricultural antibiotic and plays an important role in the biological control，duing to the advantages of broad-spectrum，efficient， non-toxic and so on.We reviewed the significant progress on lipopeptide，including the characters，isolation and identification， preparation of the pure product，genetic modification and optimization of the fermentation process. In addition，the potential application of lipopeptide are finally presented.

key words： lipopetides；isolation； identification；purification；fermentation

芽孢桿菌是一類能產(chǎn)耐高溫、抗逆的芽孢，在很多惡劣的生態(tài)環(huán)境中均能生長，且具有數(shù)量多、分布廣、繁殖快、競爭定殖能力強等特點的生防菌株，適合工業(yè)菌劑的生產(chǎn)，日益成為植物病害生物防治控制的重要研究對象。據(jù)統(tǒng)計，在全球細菌類生防菌劑產(chǎn)品中，芽孢桿菌占市場銷售額的70%以上[1]。采用芽孢桿菌生物防治技術(shù)來控制作物土傳病害得到日益重視[2，3]。芽孢桿菌對多種作物病害顯示出較好的控制效果，其抑制植物病害的機制復(fù)雜，如通過成功定殖在植物根際、體表或體內(nèi)，與病原菌競爭周圍的空間和營養(yǎng)位點，分泌抗生素、細菌素、系統(tǒng)防御酶等抗菌物質(zhì)，促進植物吸收更多的氮、磷、鉀，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性抵御病原菌入侵等。尤其是分泌脂肽類抗生素已被認為是其抑制植物病害的重要因素[4，5]。自1968年Arima等[6]在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵液中首次發(fā)現(xiàn)Surfactin以來，不斷有新的脂肽類抗生素生產(chǎn)菌株被報道在生防控制中起重要作用，并且其田間防治效果良好。Moyne等[7]從枯草芽孢桿菌AU195發(fā)酵液中鑒定了2種Bacillomycin D的同系物，對黃曲霉Aspergillus flavus具有很強的抑菌作用；Guo等[8]發(fā)現(xiàn)生防枯草芽孢桿菌NCD-2的主要抗菌物質(zhì)為Fengycin。美國Taensa公司研發(fā)的解淀粉芽孢桿菌FZB42和AS43.3主要用于防治根腐病和赤霉病，日本東京研究所研發(fā)的枯草芽孢桿菌RB14主要用于防治枯萎病，中國東北農(nóng)業(yè)大學(xué)枯草芽孢桿菌B006脂肽類抗生素主要用于防治黃瓜枯萎病。脂肽類抗生素因其具有廣譜、高效、安全無毒、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點而備受食品化妝品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、農(nóng)業(yè)等相關(guān)行業(yè)的青睞，尤其成為國內(nèi)外在生物防治方面研究的重點。本文綜述了芽孢桿菌脂肽類抗生素的種類和特性、快速分離、鑒定及純品制備的方法、基因改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化等研究進展，并對其未來的研究前景進行了展望。

1 脂肽類抗生素的種類和特性

脂肽類抗生素根據(jù)其結(jié)構(gòu)上的差異分為Surfactin、Iturin、Fengycin A或B等三大家族和一些結(jié)構(gòu)未知的環(huán)肽抗生素[9]。Surfactin家族的脂肽類化合物是由7個氨基酸的肽鏈與β-羥基脂肪酸鏈（C13-C16）交聯(lián)形成的內(nèi)酯環(huán)狀結(jié)構(gòu)[10]，是目前認為較好的生物表面活性劑，具有很強的乳化和發(fā)泡作用，可以破壞細胞膜，猜測是其三維結(jié)構(gòu)在起作用，具有很好的抗病毒、溶血、抗支原體和抗細菌的作用[11，12]，對真菌沒有太大的抑制作用，但有研究發(fā)現(xiàn)能夠增強Fengycin或Iturin對真菌的抑制效果，還能在植物根部形成一層生物膜（Biofilm）保護植物根部免受病原菌的入侵[13]。Iturin家族的抗菌脂肽由七肽與β-氨基脂肪酸鏈通過酰胺鍵相連而成，主要分為IturinA、B、C、D，也具有較強的溶血活性，但其生理活性與Surfactin不一樣，Iturin對酵母菌和真菌有很強的抑制作用，而對細菌的抑菌活性是微弱的。Iturin主要是通過在真菌細胞膜上形成傳導(dǎo)離子的小孔來影響真菌細胞膜的通透性，細胞膜的滲透能力被改變，有研究表明Iturin能與甾醇類物質(zhì)強烈作用形成Iturin/膽固醇的復(fù)合物[14]，通過分裂酵母細胞質(zhì)膜產(chǎn)生小囊泡來影響酵母的生長[15]。Fengycin家族由β-羥基脂肪酸鏈（C14-C18）和10個氨基酸殘基的小肽組成的雙親分子，對絲狀真菌有很好的抑制作用，而對酵母和細菌無效，溶血作用比Surfactin和Iturin要弱，能抑制芳香酶（Aromatase）和磷脂酶A2的活性[16]。endprint

2 脂肽類抗生素的快速分離鑒定研究進展

目前對脂肽類抗生素分離鑒定的常規(guī)手段是采用沉淀、萃取、層析、高效液相色譜等方法。由于脂肽類抗生素具有耐強酸的性質(zhì)，采用濃鹽酸沉淀是有效的手段之一。萃取是將脂肽類抗生素溶解在某一溶劑中，進一步分離目標產(chǎn)物，常采用的溶劑有甲醇、乙醇、氯仿/甲醇等，其中甲醇是使用最多的溶劑，其能溶解大多數(shù)脂肽抗生素。層析是為了進一步將不同類的脂肽抗生素分離純化，包括薄層層析（TLC）、凝膠色譜層析（GPC）等，利用脂肽抗生素標樣的遷移率來推測脂肽抗生素的種類，最后采用高效液相色譜法（HPLC）對脂肽類抗生素標樣和分離的目標產(chǎn)物進行定性和定量對比分析，從而確定各類脂肽類抗生素同系物的種類和產(chǎn)量。

抗菌活性物質(zhì)的合成與芽孢桿菌的功能基因有關(guān)[17]。Joshi等[18]報道表面活性素合成的基因（SrfAA、SrfAB）、伊枯菌素合成的基因（ituA、ituB、ituC、ituD）、豐原素合成的基因（fenB、fenD）、假定蛋白合成的基因（yndj、yngG）和枯草蛋白酶合成的基因（qk）。因此將生防菌DNA進行功能基因PCR，快速預(yù)測其可能代謝的抗生素種類，并采用不同的發(fā)酵、分離純化方法，對提高抗生素分離鑒定試驗的針對性和成功率具有重要的意義。曹云[19]利用抗生素合成基因的?；颬CR擴增生防菌SQR 9基因組DNA，快速檢測其攜帶的抗生素合成基因種類，采用HPLC等度洗脫，將分離的抑菌活性物質(zhì)經(jīng)HPLC-ESI-MS系統(tǒng)分析鑒定其成分，發(fā)現(xiàn)菌株SQR 9含有Bacillomycin和Fengycin 2種脂肽類抗生素[20]。Ye等[21]采用酸沉淀、甲醇提取和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS/MS）方法分析，鑒定枯草芽孢桿菌B47發(fā)酵液的主要成分為Iturin。LC-ESI-MS等技術(shù)是一項檢測已知結(jié)構(gòu)化合物的功能強大的新技術(shù)，但芽孢桿菌抗菌的次生代謝產(chǎn)物復(fù)雜多樣，存在許多結(jié)構(gòu)未知的抗菌活性物質(zhì)尚未鑒定，高效液相色譜—核磁共振波譜聯(lián)用（HPLC-NMR）技術(shù)為芽孢桿菌未知抗菌物質(zhì)的鑒定提供了很好的手段[22]。

3 脂肽類抗生素純品制備的研究進展

脂肽類抗生素具有廣闊的應(yīng)用前景，但其尚未得到廣泛的研究和應(yīng)用，主要是因為生防芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類抗生素種類和同系物繁多、量少，發(fā)酵液中成分又復(fù)雜，難以制備純品和大規(guī)模生產(chǎn)，有些甚至還沒有標準的檢測方法報道。分離制備純品的成本很高，目前在國內(nèi)還買不到純品，在Sigma公司只能買到Surfactin和Iturin A的純品，Surfactin≥98%（HPLC and TLC）和Iturin A≥95%（HPLC）的價格分別為10 mg 2 361.06 RMB和1 mg 1 532.70 RMB，嚴重限制了其廣泛研究和應(yīng)用。

龔慶偉[23]將芽孢桿菌發(fā)酵液經(jīng)過離心、酸沉淀、有機溶劑提取等步驟得到抗菌脂肽Surfactin、Fengycin粗提物，再通過硅膠柱層析進行初步的純化，最后過制備色譜純化得到純品，并經(jīng)過抑菌試驗、HPLC、LC-MS、MS-MS分析其純度較高，建立了一種準確定量檢測抗菌脂肽含量和制備其純品的方法，但成本昂貴，只適合實驗室制備少量純品以供研究，不能適應(yīng)商業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)，因此本文結(jié)合現(xiàn)有的研究方法，從基因改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化兩個方面對提高脂肽類抗生素產(chǎn)量進行了綜述，為進一步探究更加簡便、快速、低成本、大批量分離制備其純品提供理論和實踐依據(jù)。

3.1 基因改造

近年來隨著芽孢桿菌全基因組測序的完成，越來越多的抗菌脂肽的合成機制得以闡明，大量相關(guān)基因被克隆、分析，獲得了脂肽類抗生素合成和調(diào)控的遺傳信息[24]。周田甜[5]將生防菌Pseudomonas fluomscens的負調(diào)控基因phlF敲除，提高了菌株合成2，4-DAPG的能力并增強了抑菌活性，pWF缺失突變也增強了其在根際的競爭力；Lee等[25]利用LA-PCR技術(shù)將32 kb長度的Surfactin操縱子srfA擴增后連接到pIndigo BAC 536載體，將載體轉(zhuǎn)入E.coli DH10B獲得轉(zhuǎn)化子E.coli ET2，其代謝產(chǎn)物經(jīng)TLC分析證實含有Surfactin。Ohno等[26]將Bacillus subtilis RB14基因組中表面活性素合成必需基因lpa14連接到pC112載體，然后將其轉(zhuǎn)導(dǎo)進入另一枯草芽孢桿菌獲得Bacillus subtilis MI113基因工程菌，該菌在37 ℃發(fā)酵產(chǎn)生Surfactin的量是Bacillus subtilis RB14產(chǎn)生量的8倍。對生防菌株基因修飾改造，是一種獲得高產(chǎn)量脂肽類抗生素的有效手段，將不同功能基因的基因簇整合到其他生防菌株基因組中，有望構(gòu)建產(chǎn)多種抗生素的工程菌株。

3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

芽孢桿菌合成次級代謝產(chǎn)物的能力與外界環(huán)境和營養(yǎng)條件密切相關(guān)，發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化與否直接影響代謝方式，從而影響目的產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量[27]。在有些發(fā)酵中營養(yǎng)缺乏是抗生素開始合成的條件，比如當碳源或氮源的量成為一個限制性因素，菌體的生長就會迅速減慢，從而開啟次級代謝產(chǎn)物抗生素的合成途徑，而且在不同的發(fā)酵培養(yǎng)時間下分泌的抗菌素種類不同，通常在指數(shù)生長期向穩(wěn)定生長期過渡的過程中產(chǎn)生大量Surfactin，在穩(wěn)定生長期的早期產(chǎn)生Fengycin，在更加靠后的時間段內(nèi)產(chǎn)生伊枯菌素[28，29]。He等[30]在發(fā)酵溫度26.3 ℃，初始pH 6.0，裝液量72.4%，轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量5%，發(fā)酵周期2 d的條件下獲得最大的抗生素產(chǎn)量。Zhu等[31]采用響應(yīng)曲面試驗設(shè)計，在豆粕5 g、稻草4 g、pH 7.0、2%麥芽糖和2.65%甘油培養(yǎng)條件下，解淀粉芽孢桿菌XZ-173產(chǎn)生的Surfactin最高，為15.03 mg/gds。因此優(yōu)化發(fā)酵工藝是提高發(fā)酵水平的重要途徑，對穩(wěn)定代謝產(chǎn)物中的成分、降低發(fā)酵成本、提高抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)率具有重要的意義，為規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。針對不同脂肽類抗生素純品的制備，調(diào)節(jié)生防菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝條件，以期在不同的環(huán)境和營養(yǎng)下得到相對專一的代謝抗菌物質(zhì)并獲得最高產(chǎn)量，為脂肽類抗生素純品的大量制備提供前提條件和物質(zhì)基礎(chǔ)，從而獲得更加簡便、快速、低成本、大批量分離制備其純品的方法。endprint

4 問題與展望

4.1 探究影響抗生素以及相關(guān)功能基因表達的土壤因子

生防芽孢桿菌在植物根際定殖是一個復(fù)雜過程，受到植物和微生物間相互作用以及多個環(huán)境因素的影響，現(xiàn)階段大都停留在室內(nèi)或盆栽植物根際中研究菌株的定殖機制，而實際的土壤環(huán)境因子遠比人工培養(yǎng)條件要復(fù)雜，因此得出的結(jié)論還不能證明在田間也能有較好的生防效果，土壤因子能誘導(dǎo)或抑制防病相關(guān)基因和一些潛在的功能基因表達[32，33]。土壤中的貧營養(yǎng)環(huán)境脅迫很可能調(diào)控芽孢桿菌的生理狀態(tài)，使之有利于抗菌物質(zhì)的合成。Szczech等[34]研究發(fā)現(xiàn)在種植番茄土壤中施用RB14菌劑后，土壤Iturin抗生素濃度逐漸增加。周田甜[5]對篩選的生防菌Pseudomonas fluomscens利用基因修飾手段，使得2，4-DAPG產(chǎn)量提高，但并未顯著增強菌株在盆栽試驗中對番茄青枯病的生防效果，可能是由于土壤中營養(yǎng)物質(zhì)、溫度和水分的不恰當，導(dǎo)致拮抗物質(zhì)合成受到抑制；另外土壤顆粒成分吸附菌株產(chǎn)生的抗生素，使2，4-DAPG在根際作用的有效濃度降低，也可能是影響實際生防效果的原因。因此，有必要研究芽孢桿菌施入土壤后，起生防作用的主要抗菌物質(zhì)及其相關(guān)基因表達量的變化規(guī)律。分析土壤因子對生防菌株脂肽類抗生素合成的影響，篩選實際土壤中產(chǎn)生顯著生防效果的主要芽孢桿菌抗菌物質(zhì)種類和含量及其關(guān)鍵功能基因，優(yōu)化土壤條件因子；采用定量PCR、GFP標記等技術(shù)探明影響抗生素功能基因表達的土壤環(huán)境因子，是今后研究工作的重點和難點，以期為芽孢桿菌田間生防潛力穩(wěn)定發(fā)揮提供科學(xué)依據(jù)。

4.2 挖掘更多潛在的天然新型農(nóng)用抗生素

這些已知抗菌基因研究進展揭示了一定的生防機理，但僅局限在少量的幾種防病相關(guān)基因表達調(diào)控研究。而芽孢桿菌基因組中有4%～5%的抗菌相關(guān)基因，還蘊藏著大量未知的抗菌活性物質(zhì)及其潛在的相關(guān)基因[35，36]。近年來全基因組測序的快速發(fā)展為發(fā)現(xiàn)更多潛在的天然新型農(nóng)用抗生素的研究提供了更有效全面的手段[32，37]。對生防菌株進行全基因組測序，對已知的和未知潛在的功能基因進行注釋，應(yīng)用蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定功能基因，采用基因敲除、基因隨機突變和定位突變等方法，對突變菌株進行篩選，將生防菌株改造成功能明確、強大的工程菌株是正在研究的重要方向之一。另外，改變發(fā)酵菌株的營養(yǎng)物質(zhì)和生長條件，例如C源、N源、微量元素、pH、礦物質(zhì)、溫度、溶氧量、轉(zhuǎn)速等，誘導(dǎo)其在不同條件下產(chǎn)生不同的次級代謝產(chǎn)物，分離純化代謝產(chǎn)物并對不同的組分進行體外抑菌試驗，利用LC-ESI-MS、HPLC-NMR等技術(shù)分析鑒定其抗菌物質(zhì)，以期研究發(fā)現(xiàn)更多的天然新型農(nóng)用抗生素。

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