不同產(chǎn)地苕葉細辛中馬兜鈴酸A的HPLC測定

高智席等

摘要：建立了反相高效液相色譜法測定苕葉細辛（Asarum Insigne Diels）中馬兜鈴酸A含量的方法。色譜柱為Shim-pack VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇∶0.1%冰乙酸=70∶30（V/V）為流動相，檢測波長為225 nm。結(jié)果表明，馬兜鈴酸A在0.087 4～8.098 0 μg/mL（R2=0.999 7）范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，平均回收率為96.95%～99.42%，相對標準偏差為2.63%～3.72%，檢測限為0.003 μg/mL。該方法靈敏度高、操作簡便、結(jié)果準確、重復(fù)性好，可用于苕葉細辛中馬兜鈴酸A的測定。

關(guān)鍵詞：苕葉細辛（Asarum Insigne Diels）；馬兜鈴酸A；反相高效液相色譜法

中圖分類號：O657.7+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-3008-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.054

Determination of Aristolochic acid A in Asarum Insigne Diels

from Different Places by HPLC

GAO Zhi-xi1，2， LI Si1， JIANG Zhong-yuan1， HU Hai-jun2， HAN Chang2， L？譈 Chao-yan2

（1. Laboratory of Utilization Research on Characteristic Resources in Qianbei， Zunyi 563002， Guizhou， China；

2.institute of Agricultural science and Technology， Zunyi Normal College，Zunyi 563002， Guizhou， China）

Abstract： Aristolochic acid A in Asarum insigne Diels was determined by reversed-phase high performance liquid chromatography （HPLC）. The analysis was performed with Shim-pack VP-ODS column（150 mm × 4.6 mm，5 μm） with the mobile phase of MeOH∶0.1%acetic acid=70∶30（V/V） at 225 nm. The results showed that the Aristolo chicacid A had a good linear relationship in the range of 0.087 4～8.098 0 μg/mL（R2=0.999 7）. The average recoveries were 96.95%～99.42% with RSD of 2.63%～3.72%， and the detection limit was 0.003 μg/mL. This method is sensitive， convenient， accurate and reproducible for determining aristolochic acid A in Asarum insigne Diels.

Key words： Asarum insigne Diels； aristolochic acid A； RP-HPLC

苕葉細辛（Asarum insigne Diels）為馬兜鈴科細辛屬植物，常作中草藥使用，以全草入藥，具有祛風(fēng)散寒、止咳祛痰、活血解毒、止痛之功效，臨床上用于治療風(fēng)寒感冒、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)疼痛、咳嗽、跌打損傷等。馬兜鈴酸A為硝基菲酸類化合物，可作用腎小管上皮細胞、腎間質(zhì)成纖維細胞，降低腎小球濾過率，使血、尿肌酐增加，引起腎衰竭，急性馬兜鈴酸腎病、腎小管功能障礙型馬兜鈴酸腎病、慢性馬兜鈴酸腎病及癌癥等[1，2]。因此分析苕葉細辛中的馬兜鈴酸A對指導(dǎo)苕葉細辛的用藥量具有重要意義。目前分析馬兜鈴酸A的方法包括高效液相色譜法[3，4]、薄層色譜法[5]。本試驗建立了反相高效液相色譜法測定馬兜鈴酸A含量方法，其靈敏度高，分離效果好，為細辛屬植物中馬兜鈴酸A的含量分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

馬兜鈴酸A標準品（110746-200507）購于中國藥品生物制品檢定所，分析純甲醇購于成都市科龍化工試劑廠，去離子水。所有溶液使用前均由0.45 μm孔徑的濾膜過濾。市售5批苕葉細辛樣品由遵義醫(yī)學(xué)院黎剛老師鑒定，0～5 ℃保藏待用。

1.2 儀器

2010AT型高效液相色譜儀，LC solution工作站，CBM-20A控制器，SPD-M20A二極管陣列檢測器，SIL-20A自動進樣器（日本島津公司生產(chǎn)），SY3200超聲波清洗器（上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)），電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱Shim-pack VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇：0.1%冰乙酸水溶液（70∶30，V/V）；紫外檢測波長225 nm；流速0.6 mL/min；進樣量20 μL。

1.3.2 標準溶液的配制 稱取干燥至恒重的馬兜鈴酸A對照品13.6 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇25 mL，超聲處理25 min，溶解放冷，加甲醇至刻度，搖勻，即為544 μg/mL馬兜鈴酸A儲備液，冷藏備用。取配好的標準溶液1.0 mL于25 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，同法按該比例稀釋獲得梯度溶液，冷藏備用。

1.3.3 樣品前處理 稱取干燥的苕葉細辛藥材粉末約1 g于25 mL容量瓶中，加入含10%（V/V）甲酸的丙酮溶液20 mL，浸泡7 d，超聲提取45 min，放冷，定容至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過濾，冷藏待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

通過二極管陣列檢測器在線掃描馬兜鈴酸A標準溶液，其紫外-可見吸收光譜見圖1，其3個吸收峰的最大吸收波長分別為206、225和250 nm?？紤]溶劑基體干擾、靈敏度、分離度等因素，選定225 nm為檢測波長。該條件下，對樣品測定無影響，且色譜峰形較好。

2.2 流速的選擇

以甲醇和0.1%冰乙酸（V/V=70∶30）為試劑空白，測定不同流速（0.5～1.2 mL/min）對標準品保留時間的影響，結(jié)果表明當(dāng)流速為0.6 mL/min時，馬兜鈴酸A的出峰時間較早，分離效果較好，故選擇流速為0.6 mL/min。

2.3 流動相的選擇

分析不同體積比例的甲醇與0.1%冰乙酸流動相，由50∶50（V/V）增至95∶5（V/V），結(jié)果表明，馬兜鈴酸A的保留時間隨甲醇比例升高而減少，峰面積也逐漸增大，故選擇甲醇∶0.1%冰乙酸水溶液為70∶30 （V/V）作為流動相。

2.4 線性范圍及檢出限

將系列梯度濃度的標準液進樣分析，繪制峰面積A對濃度C的標準曲線，得線性方程為Y=178 503X+51 470，R2=0.999 7，線性范圍為0.087 4～8.098 0 μg/mL；馬兜鈴酸A保留時間為15 min（圖2和圖3）。按上述色譜條件測定5 次，求出其標準偏差，方法檢出限為0.003 μg/mL。

2.5 方法評價

取同一批苕葉細辛藥材粉末6份，平行測定馬兜鈴酸A的含量，其RSD為2.26%，表明方法重復(fù)性良好；取樣品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h測定馬兜鈴酸A，其峰面積RSD為1.78%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

在貴州苕葉細辛樣品分別添加0.01、0.05、0.10 mg/kg 3個水平的馬兜鈴酸A，經(jīng)上述方法分析，計算回收率在96.95%～99.42%之間，RSD（n=3）為2.63%～3.72%，該法靈敏度、精密度、重復(fù)性以及回收率符合相關(guān)標準要求，適用于苕葉細辛樣品中馬兜鈴酸A的測定。

2.6 樣品測定

測定不同產(chǎn)地苕葉細辛樣品中的馬兜鈴酸A含量，結(jié)果見表1。

3 小結(jié)

本試驗建立了苕葉細辛中馬兜鈴酸A的RP-HPLC的測定方法。結(jié)果表明，來源于貴州、廣西、廣東和新疆的苕葉細辛中的馬兜鈴酸A含量均高于0.025 mg/g。該方法檢出限低、重現(xiàn)性好、精密度高，并且操作簡便、快速，適用于苕葉細辛樣品中馬兜鈴酸A的測定。

參考文獻：

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