大理蒼山兩條溪流中水生絲孢菌資源調(diào)查及比較

劉曉英，羅宗龍，李琴艷，王如瀟，陶星辰，王立偉，蘇鴻雁*

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理　671000；2.大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理　671003）

大理蒼山兩條溪流中水生絲孢菌資源調(diào)查及比較

劉曉英1，羅宗龍2，李琴艷2，王如瀟1，陶星辰1，王立偉2，蘇鴻雁2*

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；2.大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理671003）

［摘要］目的：調(diào)查黑龍溪和萬花溪水生真菌資源，比較其差異性。方法：2013年3月份從黑龍溪和萬花溪中各采集沉水腐木50份，采用保濕培養(yǎng)法對(duì)水生真菌進(jìn)行培養(yǎng)，基于形態(tài)學(xué)特征對(duì)水生真菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果：共分離鑒定出48種水生絲孢菌，萬花溪30種，黑龍溪21種，Kostermansinda nanum、Phaeoisaria clematidis和Sporidesmiella rosae在兩條溪中都有出現(xiàn)。結(jié)論：黑龍溪和萬花溪中水生真菌資源豐富，人工建壩對(duì)真菌群落有影響。

［關(guān)鍵詞］水生真菌；資源；調(diào)查；沉水腐木

［DOI］10.3969/j.issn.1672-2345.2015.06.015

水生真菌在生態(tài)系統(tǒng)中具有非常重要的作用〔1〕。據(jù)估計(jì)，全球約有1.5億種真菌〔2〕，但已發(fā)現(xiàn)的真菌只占5%，大約7萬種，且多數(shù)為陸地真菌〔3〕。盡管從上個(gè)世紀(jì)40年代開始就有水生真菌的報(bào)道，但與陸地真菌相比較，對(duì)這一類群真菌的多樣性仍然知之甚少〔4〕。直到2007年，大約3 000種真菌報(bào)道于水環(huán)境〔5-6〕。對(duì)水生真菌的研究主要集中于歐洲、北美洲及東南亞地區(qū)〔7〕，世界上仍有很多地區(qū)，例如中國大陸、非洲、南美洲、澳大利亞、北極地區(qū)以及全球范圍內(nèi)的熱帶地區(qū)的水生真菌研究工作有待加強(qiáng)〔5〕。在熱帶和亞熱帶地區(qū)，已經(jīng)有許多水生真菌報(bào)道于河流或小溪，如香港〔8〕、昆士蘭北部、澳大利亞和塞舌爾〔9-10〕。在溫帶地區(qū)尤其是美國和英國〔11-13〕也有相應(yīng)報(bào)道。

云南具有復(fù)雜的氣候和自然環(huán)境，20世紀(jì)80年代楊發(fā)蓉和丁樺孫對(duì)滇池〔14〕、洱?！?5〕、長湖〔16〕等地的水生真菌進(jìn)行過研究，但其研究對(duì)象基本是低等水生真菌。2000年，云南大學(xué)研究人員開始在云南不同地域?qū)λ婢郝涠鄻有约捌渖鷳B(tài)學(xué)方面進(jìn)行了系統(tǒng)性研究〔17-21〕。迄今為止，未見關(guān)于大理蒼山十八溪水生絲孢菌的研究報(bào)道。本項(xiàng)目對(duì)蒼山黑龍溪和萬花溪中沉水腐木上的水生絲孢菌資源進(jìn)行調(diào)查，并進(jìn)行比較分析，所得結(jié)果將為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1樣品采集蒼山位于大理州中部，呈南北走向，地跨東經(jīng)99°54′30′′～100°12′12′′、北緯25°33′30′′～25°59′48′′，最高點(diǎn)海拔4 122 m，萬花溪和黑龍溪分別為蒼山東坡十八溪中由北往南的第二溪和第十四溪〔22〕。2013年3月份，分別沿黑龍溪和萬花溪岸邊，由下游往上游各隨機(jī)采集樣品50份。采集的樣品為長期浸泡在溪水中的腐木，腐爛程度一般通過肉眼即可判斷，采集時(shí)盡量選擇表皮脫落，指甲掐壓時(shí)松軟的木頭。腐木大小以直徑1～5 cm，長20～30 cm為宜。采集到的樣品裝入自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行保濕培養(yǎng)。

1.2培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水加至1 000 mL。

WA培養(yǎng)基：瓊脂18 g，蒸餾水加至1 000 mL。MEA培養(yǎng)基：麥芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，瓊脂18 g，蒸餾水加至1 000 mL。以上培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，20 min），待其冷卻至50℃以下加入氨芐青霉素，終濃度為100 μg/mL，倒入無菌平板中備用。

1.3樣品處理將采集回來的樣品按地點(diǎn)編號(hào)后放入用酒精消毒后的封閉塑料盒中，盒底鋪上滅菌的吸水紙用于保濕，吸水紙上再放上滅菌吸管適當(dāng)隔離，噴灑適量無菌水，室溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)，一周后開始觀察。在體視鏡下觀察到真菌子實(shí)體后，用大頭針標(biāo)記出觀察到的區(qū)域，再用解剖針挑出目的真菌制成水玻片，在OLYMPUS BX51顯微鏡下觀察并使用Image-Pro Express C軟件拍照并測量。采用單孢分離技術(shù)，在無菌操作臺(tái)中將孢子用無菌解剖針或削尖的牙簽轉(zhuǎn)接到事先準(zhǔn)備好的PDA平板中，室溫培養(yǎng)24 h后觀察萌發(fā)，待其萌發(fā)后挑取一到兩個(gè)孢子制片并在顯微鏡下觀察并拍照，平板上其余孢子單個(gè)轉(zhuǎn)移到新的PDA或MEA上，室溫培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)。干標(biāo)本及純培養(yǎng)一式三份進(jìn)行保存。

1.4水生絲孢菌鑒定查找相關(guān)文獻(xiàn)〔23-25〕，根據(jù)分生孢子梗和產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)特征以及分生孢子的形成方式、大小、形狀、顏色、分隔、附屬物、內(nèi)部有無油滴狀內(nèi)含物等特征將其鑒定到屬、種。

1.5水生絲孢菌統(tǒng)計(jì)

水生絲孢菌出現(xiàn)頻率（%）=（某個(gè)種出現(xiàn)次數(shù)/樣品總數(shù)）×100%

比較黑龍溪和萬花溪中水生真菌物種組成相似性，采用辛普森相似指數(shù)（S）進(jìn)行比較〔26〕。

S=2c/（a+b），其中，a=黑龍溪中的水生絲孢菌種數(shù)，b=萬花溪中的水生絲孢菌種數(shù)，c=在兩條溪中都有的水生絲孢菌種數(shù)，S=0表示不相似，S=1表示完全相似。

采用香農(nóng)-威納指數(shù)（H）來反映黑龍溪和萬花溪中水生絲孢菌多樣性〔21〕。

其中，Ni=第i個(gè)種的檢出次數(shù)，N=所有種的檢出次數(shù)，lnpi=pi的自然對(duì)數(shù)。

2　結(jié)果

在黑龍溪和萬花溪中采集并鑒定出水生絲孢菌共48種，其中黑龍溪30種，萬花溪21種，見表1。從形態(tài)上初步鑒定出13個(gè)可能的新種（在表1中以屬名+sp.表示），還需進(jìn)一步采用分子生物學(xué)技術(shù)來確定這些新種的分類地位。黑龍溪中常見種為Helico?sporiumguianense、Sporidesmium adscendens、Hel?minthosporium velutinum。萬花溪中常見種為Helico?myces tenuis、Phaeoisaria clematidis、Monodictys moni?licellularis。兩條溪共有的種只有3個(gè)，分別是Kos?termansinda nanum、P.clematidis、Sporidesmiella ro?sae，而且他們出現(xiàn)的頻率也不一樣。通過計(jì)算得出黑龍溪和萬花溪中水生真菌物種組成的相似指數(shù)為0.12（見表1），說明這兩條溪中水生絲孢菌具有較大差異。黑龍溪和萬花溪中水生絲孢菌的香農(nóng)-威納指數(shù)（H）分別為3.67和2.22（見表1），表明黑龍溪中的水生絲孢菌多樣性明顯高于萬花溪中的水生絲孢菌多樣性。

表1　黑龍溪和萬花溪中沉水腐木上水生絲孢菌出現(xiàn)頻率

續(xù)表

3　討論

Shearer等〔5〕在2007年預(yù)測淡水中有大量的真菌有待發(fā)現(xiàn)，本次研究選取蒼山十八溪中的兩條溪進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了13個(gè)可能的新種，與這一預(yù)測相符；從調(diào)查結(jié)果可知，黑龍溪和萬花溪中水生絲孢菌資源豐富，其中以K.nanum、P.clematidis和S.rosae為常見種，蒼山另外十六條溪中的水生真菌還有待研究。

黑龍溪和萬花溪中真菌群落差異性較大，萬花溪中的水生絲孢菌的多樣性低于黑龍溪中的水生真菌多樣性。影響淡水生境中水生絲孢菌群落及多樣性的因素有很多，主要包括：生境、水質(zhì)、水污染、真菌生長基質(zhì)、地理氣候條件、岸邊植被等〔21〕。水生真菌的淡水生境一般分3種類型：靜態(tài)生境（如湖泊、池塘、水池、沼澤地等）、動(dòng)態(tài)生境（如河流、溪流等）和人工生境（如冷水塔、人工水庫等）〔27〕。本研究選取的黑龍溪和萬花溪皆屬于動(dòng)態(tài)生境，淡水生境一致。馬根連于2012年對(duì)蒼山十八溪水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測評(píng)價(jià)，其中萬花溪和黑龍溪出山口水質(zhì)均為Ⅱ類〔28〕，可認(rèn)為兩條溪流水質(zhì)基本相同。兩條溪相距19 km左右，地理氣候條件差異不大，岸邊植被種類也類似，在采集沉水腐木過程中皆是隨機(jī)采集，因此，兩條溪流的地理氣候條件、岸邊植被、真菌生長基質(zhì)的差異不大。萬花溪水電站于1960年建成，在萬花溪上游修建了蓄水大壩，大壩附近植被遭到破壞，截流蓄水導(dǎo)致萬花溪下游出現(xiàn)斷流現(xiàn)象，進(jìn)而影響水生真菌的生存環(huán)境。本研究認(rèn)為兩條溪真菌群落差異較大并且萬花溪中的水生絲孢菌的多樣性低于黑龍溪中的水生真菌多樣性的主要原因是修建了蓄水大壩，這一結(jié)論與胡殿明〔21〕所持觀點(diǎn)相同。

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（責(zé)任編輯毛本勇）

［中圖分類號(hào)］Q948

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［文章編號(hào)］1672-2345（2015）06-0058-04

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31360013；31460015）；云南省中青年學(xué)術(shù)帶頭人資助項(xiàng)目（2012HB-042）；云南省高校滇西生物多樣性科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目（云教函〔2011〕93號(hào)）；大理學(xué)院質(zhì)量工程項(xiàng)目（TDI-05）

［收稿日期］2015-03-30［修回日期］2015-04-14

［作者簡介］劉曉英，碩士研究生，主要從事微生物及疾病研究.

*通信作者：蘇鴻雁，教授.

Investigation and Comparison of Freshwater Hyphomycetes between Two Streams in Cangshan Mountain in Dali

Liu Xiaoying1，Luo Zonglong2，Li Qinyan2，Wang Ruxiao1，Tao Xingchen1，Wang Liwei2，Su Hongyan2*
（1.Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.College of Agriculture and Biology Science，Dali University，Dali，Yunnan 671003，China）

〔Abstract〕Objective：To find out the resources of freshwater hyphomycetes from Heilong Stream and Wanhua Stream and compare their differences.Methods：50 samples were collected from each stream，using Moist Incubation Method to incubate the fungi，identifying the fungi based on the morphological characters.Results：48 species of freshwater hyphomycetes were find out with 30 species from Heilong Stream and 21 species from Wanhua Stream.Kostermansinda nanum，Phaeoisaria clematidis and Sporidesmiella rosae were found from both streams.Conclusion：The resources of freshwater hyphomycetes are abundant in Heilong Stream and Wanhua Stream，and artificial dam can affect the communities of freshwater fungi.

〔Key words〕freshwater fungi；resources；investigation；submerged decayed wood