ATRP 技術(shù)制備單分散樹(shù)脂接枝聚乙烯基咪唑的色譜固定相及其在核苷類(lèi)化合物分離中的應(yīng)用

鄭慶忠，賈 瑋，龔波林

（1.寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏大學(xué)天然氣轉(zhuǎn)化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，寧夏銀川 750021）

核苷類(lèi)物質(zhì)因具有抗病毒、抗腫瘤活性，市場(chǎng)需求日益加大，但核苷類(lèi)藥物的生產(chǎn)還面臨很多亟待解決的問(wèn)題，其中，探索高效的分離介質(zhì)和技術(shù)就是一個(gè)重要的研究課題。

目前，由“點(diǎn)擊化學(xué)”硅膠鍵合烯丙基咪唑固定相已經(jīng)成功地應(yīng)用于酚類(lèi)、胺類(lèi)有機(jī)化合物，無(wú)機(jī)陰離子等的分離[1]，但以單分散交聯(lián)聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯聚合物（PGMA/EDMA）微球?yàn)榛|(zhì)，鍵合乙烯基咪唑在以上提到的幾類(lèi)物質(zhì)及核苷類(lèi)物質(zhì)分離中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以PGMA/EDMA聚合物微球?yàn)榛|(zhì)，在原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（Atom Transfer Radical Polymerization，ATRP）技術(shù)下[2-6]，將聚乙烯基咪唑鍵合于聚合物微球表面制備得聚乙烯基咪唑色譜固定相，并成功地應(yīng)用于核苷類(lèi)化合物的分離。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器及試劑

LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司），傅里葉變換紅外光譜儀（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），CGY-100 型高壓氣動(dòng)泵（北京福思源機(jī)械加工部），KQ-250B 超聲波清洗器（昆山市超生儀器有限工司），JY92-II 超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），XSP-3CA1 生物顯微鏡（上海光學(xué)儀器六廠(chǎng)），LD5-2A 型低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)）。聚乙烯吡咯烷酮（PVP），過(guò)氧化苯甲酰（BPO），偶氮二異丁腈（AIBN），十二烷基磺酸鈉（SDS），聚乙烯醇（PVA），乙烯基咪唑（VI），溴異丁酰溴（BrIBuBr），2，2-聯(lián)吡啶，尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷及其他所用溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?shí)驗(yàn)用水均用電阻率為18.3 MΩ·cm去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 合成單分散交聯(lián)聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯（PGMA/EDMA）微球 取采用分散聚合法制備粒徑為3 μm 的線(xiàn)性苯乙烯（PS）種子若干于三頸瓶中，采用一步種子溶脹聚合法，加入適量的0.2 % SDS 溶液，在室溫下進(jìn)行攪拌活化。取一定量的甲基丙烯酸縮水甘油酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、過(guò)氧化苯甲酰（BPO）于干燥的燒杯中，超聲使過(guò)氧化苯甲酰完全溶解，然后加入一定量的甲苯、環(huán)己醇、PVA 和SDS，置于超聲波細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行超聲乳化至無(wú)油滴后，迅速加入到活化后的聚苯乙烯種子溶液中，室溫下攪拌溶脹24 h，按照文獻(xiàn)方法[7-8]制備了粒徑為7 μm 的單分散多孔PGMA/EDMA微球。將合成的PGMA/EDMA微球裝入索式提取儀中，用甲苯抽提48 h。抽提后的微球用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌，60 ℃下真空干燥，即得7.0 μm 親水性單分散交聯(lián)PGMA/EDMA微球。

1.2.2 PGMA/EDMA微球的化學(xué)改性 將一定量干燥后的PGMA/EDMA微球加到0.1 mol/L 稀硫酸中，水浴加熱下攪拌反應(yīng)24 h，停止反應(yīng)后大量水洗至中性，再分別用乙醇，丙酮洗滌三次，45 ℃真空干燥24 h，得酸化微球。取上述酸化微球置于100 mL 圓底燒瓶中，加入一定量的無(wú)水THF，攪拌1 h 后，冰浴下加入2 %的三乙胺，30 min 后，緩慢加入2 %的溴異丁酰溴，室溫下反應(yīng)24 h。用無(wú)水THF、水、丙酮依次洗滌后，置于40 ℃下真空干燥，制備得高分子溴引發(fā)劑。

圖1 乙烯基咪唑色譜固定相的合成路線(xiàn)Fig.1 Synthetic approach to poly-vinylimidazole chromatogram stationary phase

1.2.3 乙烯基咪唑聚合物固定相的制備 按照摩爾量引發(fā)劑：催化劑：配位劑：?jiǎn)误w=1：1：5：100 在100 mL圓底燒瓶中加入一定量乙烯基咪唑（VI）單體在若干溶劑甲苯中超聲分散均勻。在另一個(gè)100 mL 圓底燒瓶中加入上步所得溴引發(fā)劑2 g，0.4 mmol 氯化亞銅，0.4 mmol 的氯化銅和2 mmol 的配體-聯(lián)吡啶，抽真空-通N230 min，在45 ℃下攪拌反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后離心、洗滌，40 ℃下真空干燥，制得弱陰離子交換色譜填料。乙烯基咪唑鍵合PGMA/EDMA聚合物微球的離子交換色譜填料的合成路線(xiàn)（見(jiàn)圖1）。

1.3 固定相的表征

合成的固定相顆粒大小與改性后聚合物的表觀形態(tài)用掃描電子顯微鏡觀測(cè)；傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜表征；元素分析分別測(cè)定PGMA/EDMA微球和ATRP-1 色譜固定相的C，H，N 元素的含量。根據(jù)公式（1）計(jì)算得乙烯基咪唑色譜固定相的鍵合量。

式中：%N-單位體積色譜固定相表面N 元素的百分含量；NN-單位體積的單體中N 元素的個(gè)數(shù)；MN-N元素的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.4 色譜柱的裝填及色譜條件

以甲醇為勻漿液、蒸餾水為頂替液，在30 MPa 壓力下以勻漿法分別將自制的乙烯基咪唑色譜填料裝入不銹鋼柱管（10 cm×0.46 cm I·D）中并標(biāo)號(hào)為ATRP柱。（1）色譜條件：甲醇與水；（2）檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm。所有流動(dòng)相在使用前均經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙烯基咪唑色譜固定相的結(jié)構(gòu)表征

紅外光譜和元素分析表明，乙烯基咪唑單體被成功接枝到PGMA/EDMA微球上，根據(jù)式（1）計(jì)算得乙烯基咪唑色譜固定相中乙烯基咪唑的鍵合量為3.98%。

2.2 乙烯基咪唑色譜柱在核苷分離中的應(yīng)用

親水作用色譜（HILIC）作為一種分離極性化合物的液相色譜模式，近年來(lái)越來(lái)越受到關(guān)注和重視。主要是因?yàn)閺?qiáng)極性化合物的分離問(wèn)題引起了各個(gè)研究領(lǐng)域的重視，其次是由于親水作用色譜具有流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單、分離效率較高、與質(zhì)譜兼容以及反壓較低等優(yōu)勢(shì)[9]。隨著流動(dòng)相極性的改變，用幾種核苷類(lèi)化合物來(lái)考察ATRP 柱在HILIC 模式下的分離的性能（見(jiàn)圖2）。

圖2 聚乙烯基咪唑柱對(duì)7 種核苷的色譜分離圖Fig.2 Chromatogram of seven nucleosides by poly-vinylimidazole column

由圖2 所示，咪唑官能團(tuán)作為原子轉(zhuǎn)移自由基聚合改性單體鍵合于交聯(lián)甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹(shù)脂表面制備所得聚乙烯基咪唑聚合物填料具有一定的親水作用。在以乙腈-醋酸銨水溶液（92：8，V/V）作為流動(dòng)相時(shí)，流速：1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm 的條件下同時(shí)分離7 種核苷類(lèi)強(qiáng)極性化合物，45 min 內(nèi)達(dá)到基線(xiàn)分離。乙腈含量對(duì)7 種核苷類(lèi)混合物的保留時(shí)間也有一定的影響，考察乙腈濃度從98 %降低到92 %，其保留時(shí)間分別減少。

鹽濃度的選擇也是影響HILIC 色譜柱保留時(shí)間的一個(gè)重要因素（見(jiàn)圖3），研究了乙腈含量一定時(shí)，不同醋酸銨濃度（10 mmol/L～80 mmol/L）、流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm 時(shí)對(duì)幾種核苷的保留時(shí)間的影響，由圖3 可知，分析得可能是由于高鹽濃度的增加導(dǎo)致固定相之間靜電斥力的增加[10]，從而隨著鹽濃度的增加，核苷的保留時(shí)間逐漸縮短。

圖3 鹽濃度對(duì)保留時(shí)間的影響Fig.3 Effect of salt concentration on retention time

2.3 穩(wěn)定性及重現(xiàn)性試驗(yàn)

用該色譜柱分離樣品運(yùn)行200 h，發(fā)現(xiàn)柱效、分離度等沒(méi)有較明顯改變，說(shuō)明該色譜填料具有良好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

采用ATRP 技術(shù)，將乙烯基咪唑成功的接枝到了自制的粒徑為7.0 μm 大孔單分散親水性交聯(lián)聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯樹(shù)脂上，得到了一種親水性良好的聚乙烯基咪唑色譜柱，對(duì)該固定相進(jìn)行元素分析，紅外光譜等進(jìn)行了表征。制備的聚乙烯基咪唑色譜柱固定相可以成功分離核苷類(lèi)化合物，并且該色譜柱具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

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