龍膽堿的抑菌活性研究

李 薇，王琳琳，余河水，張麗娟，宋新波

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193)

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽(Gentiana manshurica K itagⅠ)、三花龍膽(G entianatrif lora paⅢ)、龍膽(Gentiana scabra BgeⅠ)或堅龍膽(Gentiana rigescens FranchⅠ)的干燥根及根莖［1-2］。主要用于黃疸目赤、帶下陰癢、濕疹瘙癢、驚風(fēng)抽搐等癥的治療。龍膽苦苷(gentiop icroside)為環(huán)烯醚萜苷類成分，是中藥龍膽中的主要藥理活性成分，其主要具有抗炎抗菌、保肝利膽、健胃等作用［3-8］，但體內(nèi)研究［9-10］表明在腸道菌群的作用下龍膽苦苷體內(nèi)代謝的主要成分是龍膽堿。查閱文獻發(fā)現(xiàn)龍膽堿有和龍膽苦苷相似的藥理作用，如抗炎等。此外還有解熱，鎮(zhèn)痛等藥理作用［11-13］。由于傳統(tǒng)認(rèn)為龍膽有治療濕熱陰腫陰癢、帶下的作用，對比現(xiàn)代藥理研究筆者判斷其作用的藥理基礎(chǔ)為抑制細(xì)菌及真菌生長。因此本文對作為龍膽苦苷的腸內(nèi)主要代謝產(chǎn)物的龍膽堿的抑菌作用進行了研究。

1 材料

1.1 藥物 龍膽堿對照品(純度≥95%)，購自于中國藥品檢驗所，龍膽堿單體為實驗室自制。

1.2 實驗菌株 革蘭氏陰性菌:大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(P．Aeruginosa);革蘭氏陽性菌:金黃色葡萄球菌(Staphy lococcus aureus);真菌:白色念珠菌(Monilia albican)，均購自于天津市藥品檢驗所。

1.3 試劑與設(shè)備 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，二甲基亞砜(分析純)，氯化鈉;LS-B50L型立式圓形壓力蒸汽滅菌器，超凈工作臺，微量加樣器，LRH-150B生化培養(yǎng)箱，電熱培養(yǎng)箱。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:按照每32 g加入1 L蒸餾水的比例加入蒸餾水，邊攪拌邊加熱煮沸至溶液透明;改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基:按照每28.5 g加1 L蒸餾水的比例加入蒸餾水，加熱至完全溶解。

將2種培養(yǎng)基分別分裝于20支試管中，19.5 mL/管，密封，121℃高壓滅菌20 min，置于48～50℃水浴中備用。

2.2 菌液的制備 在無菌條件下，分別將供試菌株從固體培養(yǎng)基上接入裝有液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)進行培養(yǎng)增菌。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，于35℃培養(yǎng)18～24 h，在改良馬丁培養(yǎng)基中接種白色念珠菌，于28℃培養(yǎng)32～48 h，在菌液中加入無菌生理鹽水，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄏ♂尵褐翝舛?05CFU/mL，備用。

2.3 供試藥液的制備 精密稱取龍膽堿20 mg，溶于3 mL DMSO中，分別使用二倍稀釋法稀釋藥物至不同濃度，備用。見表1、表2。

表1 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希桿菌培養(yǎng)皿內(nèi)藥物濃度

表2 接種白色念珠菌培養(yǎng)皿內(nèi)藥物濃度

2.4 藥敏試驗

2.4.1 受試藥物培養(yǎng)基的制備 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基含藥平板的制備:分別移取各不同濃度受試藥物的供試藥液0.5 mL，加入至19.5 mL無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，振搖混勻，倒入培養(yǎng)皿，制成含藥平板，平行制備1份，備用;改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基含藥平板的制備:分別移取0.5 mL不同濃度的各個受試藥物供試藥液，加入至19.5 mL無菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，振搖混勻，倒入培養(yǎng)皿，制成含藥平板，平行制備1份，備用。

2.4.2 接種菌懸液 分別在含藥平板上接種“2．2”項下所培養(yǎng)的銅綠假單胞菌、大腸埃希桿菌、金黃色葡萄球菌，各10 μL，37 ℃下倒置培養(yǎng)18 ～24 h，觀察最低抑菌濃度。同法，在含藥平板上接種白色念珠菌10 μL，28 ℃下倒置培養(yǎng)36～48 h，觀察最低抑菌濃度。

2.4.3 陰性對照培養(yǎng)基的制備 取19.5 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，滅菌，倒入培養(yǎng)皿。平行制備1份。

2.5 陽性對照培養(yǎng)基的制備 分別在不含藥的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上接種“2.2”項下所培養(yǎng)的銅綠假單胞菌、大腸埃希桿菌、金黃色葡萄球菌，各10 μL。同法，在不含藥的改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上接種白色念珠菌10 μL。平行制備1份。

2.6 溶劑對照租培養(yǎng)基的制備 分別移取各DMSO 0.5 mL，加入至19.5 mL無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基及無菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，輕輕振搖，混勻，倒入培養(yǎng)皿;并按照“2.2”項下方法接種菌液。平行制備1份。

3 結(jié)果

3.1 實驗結(jié)果 實驗所設(shè)陰性對照組培養(yǎng)基上均無菌落生長，陽性對照組和溶劑對照組培養(yǎng)基長勢基本相同。因此本實驗選用的助溶劑DMSO 0.5 mL對實驗所用菌株的生長均無干擾作用。

3.2 最低抑菌濃度 龍膽堿對金黃色葡萄球菌、大腸埃希桿菌及銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度范圍均為0.875 0～1.750 mg/mL，對白色念珠菌的最低抑菌濃度范圍為0.903 7～1.807 mg/mL。龍膽堿對大腸埃希桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及白色念珠菌的MIC的結(jié)果。見表3。

4 結(jié)語

本研究證明龍膽堿對以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性菌和以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌，以及以白色念珠菌為代表的真菌均有不同程度的抑制作用。為龍膽治療陰腫陰癢、濕疹瘙癢提供了理論依據(jù)，為下一步的相關(guān)藥物開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。本實驗采用瓊脂二倍稀釋法，能夠提供相對準(zhǔn)確的實驗結(jié)果。且所選用助溶劑二甲基亞砜(DMSO)的濃度為2.5%安全合理。

表3 龍膽堿對各實驗菌的MIC結(jié)果

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典［M］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:89．

［2］國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會．中華本草(下冊)［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1453．

［3］劉濤，才謙，付玉芹，等．中藥龍膽的研究進展［J］．遼寧中醫(yī)雜志，2014，31(1):85-86．

［4］沈濤，金航，王元忠，等．中藥龍膽化學(xué)成分研究進展［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(30):16868-16870．

［5］王琳，聶艷瓊，孫娜，等．秦艽的化學(xué)成分、分子生藥學(xué)和藥理學(xué)研究進展［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(18):9629-9630．

［6］徐毅敏．三花龍膽化學(xué)成分及其抗炎活性研究［D］．杭州:浙江大學(xué)，2013．

［7］郭清峰，王瑋，韓文清．龍膽苦苷的藥理作用研究進展［J］．廣東化工，2014，41(17):121-122．

［8］王淼，曾文雪，宋小玲，等．龍膽苦苷藥學(xué)研究進展及其臨床配伍應(yīng)用［J］．西北藥學(xué)雜志，2012，27(5):502-505．

［9］楊肖鋒，宋純清．龍膽苦苷的腸內(nèi)菌群代謝研究［J］．中國中藥雜志，2000，25(11):673-676．

［10］郭亞健，陸蘊如．龍膽苦苷轉(zhuǎn)化為秦艽丙素等生物堿的研究［J］．藥物分析雜志，1983，3(5):268-271．

［11］劉學(xué)偉，劉樹民，柳長鳳．龍膽堿鎮(zhèn)靜催眠作用及對小鼠腦內(nèi)5-HT、GABA 含量的影響［J］．時珍國醫(yī)國藥，2012，23(2):394-396．

［12］姚素媛，劉學(xué)偉，劉樹民．龍膽堿對高熱驚厥模型大鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量及海馬區(qū)GABAB、Glu受體的影響［J］．時珍國醫(yī)國藥，2010，21(7):1633-1635．

［13］劉學(xué)偉，曹敏，劉樹民．龍膽堿的解熱作用及機制研究［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(24):128-131．