車前草水煎液對(duì)超氧自由基清除作用

盧福山， 馬貴棟*

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧810016）

車前草又名車前、車輪菜、豬耳草、錢(qián)串草等,為車前科植物車前(Plantago asiatica1)或平車前(PlantagodepressWilld1)的干燥全草[1]，青海省地區(qū)所生長(zhǎng)的車前草多為平車前，其生長(zhǎng)條件要求低，繁殖強(qiáng)、分布廣，田間地頭、路邊洼地隨處可見(jiàn)。因含多糖類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類及甾體類、揮發(fā)油、有機(jī)酸類、苯乙基咖啡酰糖酯類等多種活性物質(zhì)[2-3]，故具有許多藥理作用。王勇等[4]發(fā)現(xiàn)車前子提取液能有效抑制晶體上皮細(xì)胞（LEC）凋亡,防止白內(nèi)障的發(fā)生。黃秀榕等[5]利用車前草或車前籽提取液給小鼠灌胃,能明顯延長(zhǎng)小鼠游泳、常壓缺氧及亞硝酸鈉中毒性組織缺氧存活時(shí)間,明顯增加SOD的活性,減少過(guò)氧化脂質(zhì)（LPO)的生成,延緩衰老。王素敏等[7]認(rèn)為車前子對(duì)機(jī)體自由基的防御機(jī)能可產(chǎn)生一定的影響,對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病有一定的防治作用。本研究運(yùn)用超聲輔助研究車前草和草籽水煎液對(duì)超氧自由基清除作用，為車前草資源的開(kāi)發(fā)利用提供基本依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及采集 車前草樣品采集于青海大學(xué)校園林地及校區(qū)周邊地區(qū)，采集時(shí)間為2013年9月份，采集時(shí)用剪刀剪取地上部分和車前草草穗。

1.2 樣品的預(yù)處理

1.2.1 將車前草莖葉和草籽先用自來(lái)水洗凈，再用蒸餾水沖洗三遍，烘干，粉碎后，60目篩過(guò)篩，備用。

1.2.2 水煎液的制備：稱取車前草和草籽粉末各200 g,加蒸餾水浸泡60min后,頭煎30min,二煎30min,合并兩次煎液后，過(guò)濾并濃縮后，定容至250mL,得到車前草水煎液（水煎液Ⅰ）和草籽水煎液（水煎液Ⅱ）。

1.3 水煎液清除自由基實(shí)驗(yàn)中樣品的處理及測(cè)定

1.3.1 O2-·自由基生成及清除率的測(cè)定方法 鄰苯三酚能在弱堿條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)產(chǎn)生O2-·，O2-·清除劑能使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在λ=420mm處吸收峰受抑制[10]。用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)進(jìn)行監(jiān)測(cè),可間接測(cè)得O2-·的生成及O2-·的清除率。取4.5 mL pH8.2的50mmol/L Tris-HCl緩沖液,4.2mL蒸餾水,混勻后在25℃水浴保溫20min，取出后立即加入在25℃預(yù)熱的0.2mmol/L鄰苯三酚0.3mL，總體積9.0mL。測(cè)反應(yīng)啟動(dòng)后第10s的A420值(以pH8.2 Tris-HCl緩沖液作參比)得空白管光吸收值(即A空)。待測(cè)量所取試劑與上述一樣,只是在加入鄰苯三酚前分別加一定量水煎液Ⅰ和Ⅱ,蒸餾水減少相應(yīng)體積，測(cè)反應(yīng)啟動(dòng)后第10s時(shí)的A420值(用同濃度水煎液作為參比)即為待測(cè)管光吸收值(即A樣)。O2-·清除率S%=(A空-A樣)÷A空×100%

1.3.2·OH自由基生成及清除率的測(cè)定方法

H2O2與Fe2+作用可通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，鄰二氮菲一Fe2+水溶液被·OH氧化為鄰二氮菲—Fe3+后,其波長(zhǎng)在510mn最大吸收峰消失[11],當(dāng)體系中加入·OH清除劑后,此氧化過(guò)程受到抑制，A510將會(huì)增大。反應(yīng)體系及步驟:取0.75 mmol/L鄰二氮菲,pH 7.40的150mmol/LPBS,0.75 mmol/L FeSO4,每加一管立即混勻,最后加0.01%的過(guò)氧化氫(A損)，以雙蒸水代替H2O2(A未損)，置37℃保溫度60min,分別測(cè)510nm處的吸光度，得A損與A未損。依上方法，依次加入鄰二氮菲0.75 mmol/L,FeSO4 0.75 mmol/L,pH7.4 PBS 150mmol/L,H2O20.01%，再加入水煎液1.00mL，以同濃度水煎液作為參比測(cè)A510（即A樣）。

·OH清除率S%=(A樣-A損)÷(A未損-A損)×100%

2 結(jié)果

2.1 車前草水煎液I和II對(duì)O2-·自由基清除作用水煎液I和II對(duì)O2-·自由基清除作用見(jiàn)表1。

2.2水煎液I和II對(duì)·OH自由基清除作用 水煎液I和II對(duì)·OH自由基清除作用見(jiàn)表2。

表1 車前草水煎液I 和II 對(duì)O2-·自由基清除作用

表2 水煎液I 和II 對(duì)·OH 自由基清除作用

3 討論

許多研究表明,衰老與自由基損傷細(xì)胞有密切關(guān)系,抗氧化劑能有效捕獲自由基，所以具有抗衰老作用[12]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，車前草水煎液Ⅰ和水煎液Ⅱ?qū)︵彵饺幼匝趸磻?yīng)體系產(chǎn)生氧陰離子自由基(O2-·）、鄰二氮菲H2O2/Fe2+體系產(chǎn)生羥自由基(·OH)均有一定的清除作用，且效果明顯（P<0.05），表明車前草葉和草籽中均含一定的抗氧化物質(zhì)。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)車前草水煎液I和水煎液II盡管對(duì)自由基均有清除作用，但兩種水煎液清除O2-·自由基的效果卻存在顯著性差異（P<0.05），而對(duì)清除·OH自由基的效果無(wú)顯著差異（P>0.05），說(shuō)明車前草不同部位的組織中所含清除自由基成分不一樣，因而其藥用價(jià)值也有所不同。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2]顏佩芳.平車前的化學(xué)分析研究[D].吉林:吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院,2005.

[3]Nishibe S,SasaharaM.Phenylethanoid glycosides from Plantagodepressa[J].Phytochemistry,1993,32(4):975-977.

[4]王勇,祁明信,黃秀榕,等.車前草對(duì)晶狀體氧化損傷所致LEC凋亡抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代診斷與治療,2003,14(4):199-202.

[5]黃秀榕,祁明信,汪朝陽(yáng),等.4種歸肝經(jīng)明目中藥對(duì)品狀體上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bel-2和Bax調(diào)控[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2004,9(3):322-325.

[6]陳永祥,王和生,靳鳳云,等.一貫煎多糖對(duì)小鼠肝損傷及SOD、LPO的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,1999,34(4):239-241.

[7]王素敏,張杰,李興琴,等.車前草對(duì)高脂血癥大鼠機(jī)體白由基防御機(jī)能的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2003,23(8):529-531.

[8]迪麗努爾.莎比托夫,敏德,依布拉音,等.圓苞車前草乙醇提取物毒性及藥理實(shí)驗(yàn)研究[J].中成藥,2004,26(11):954-955.

[9]文鏡,賀素華,楊育穎.保健食品清除自由基作用的體外測(cè)定方法和原理[J].食品科學(xué),2004,25(1):190-195.

[10]陳雪峰,李一當(dāng).發(fā)菜多糖清除自由基活性的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(8):3088-3089.

[11]林力.車前子多糖成分的提取工藝研究[J].遼寧中醫(yī)學(xué)院,2002,29(4):232-233.

[12]王超,包玉雙,曲鳳玉.甘草對(duì)老年大鼠CAT、GSH-PX、LPO影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2000,23(3):6-7.