結直腸腺癌組織Caveolin-1表達與微淋巴管密度的關系及臨床意義

郭飛，薛軍，武雪亮，宇宏峰，屈明，張鵬程，孫光源，胡曉峰，王立坤

（河北北方學院附屬第一醫(yī)院血管腺體外科，河北張家口075000）

結直腸腺癌組織Caveolin-1表達與微淋巴管密度的關系及臨床意義

郭飛，薛軍，武雪亮，宇宏峰，屈明，張鵬程，孫光源，胡曉峰，王立坤

（河北北方學院附屬第一醫(yī)院血管腺體外科，河北張家口075000）

目的：探索結直腸腺癌中Caveolin-1和微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）的關系及其與腫瘤臨床病理特征和預后的關聯(lián)。方法運用免疫組織化學法測定90例結直腸腺癌和45例正常結直腸組織中Caveolin-1的表達，并以D2-40為標記物，測定結直腸腺癌組織的LMVD，分析Caveolin-1和LMVD與臨床病理參數(shù)之間的關聯(lián)。結果：結直腸腺癌中Caveolin-1蛋白的陽性表達率（73.33%）明顯高于正常結直腸組織（11.11%，P＜0.01）；結直腸腺癌中的LMVD值（18.25±2.36）明顯高于正常結直腸組織（3.14±1.58，P＜0.01）；Caveolin-1表達程度和LMVD與肝轉移、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期具有相關性（P＜0.01）；Caveolin-1表達陰性組的LMVD值明顯低于陽性組（P＜0.01）；結論Caveolin-1在結直腸癌中的表達與微淋巴管生成密切相關，其表達和LMVD是結直腸癌患者的獨立預后指標。

結直腸腺癌；Caveolin-1；微淋巴管密度；免疫組織化學

結直腸癌嚴重威脅人類的健康，是較常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢［1］。腫瘤的轉移是決定患者預后的重要影響因素，而淋巴結轉移是腫瘤轉移的重要途徑。微淋巴管密度（lymphaticmicrovessel density，LMVD）作為微淋巴管新生能力的重要指標，能夠反映惡性腫瘤的進展程度［2］。Caveolin-1參與調控細胞的物質轉運、信號轉導、增殖分化、遷移、凋亡等，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，在腫瘤細胞侵襲轉移過程中起重要作用［3］。D2-40是淋巴管內皮細胞特異性最高的標志物［4-5］。本研究擬采用免疫組織化學法測定Caveolin-1在結直腸腺癌組織和正常結直腸組織中的表達，同時在結直腸腺癌組織中運用D2-40標記LMVD，分析Caveolin-1和LMVD與臨床病理參數(shù)及結直腸癌患者預后的關聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

采集河北北方學院附屬第一醫(yī)院2012年7月至2014年7月胃腸腫瘤外科手術切除的90例結直腸癌組織。癌組織取自癌灶中心，另取其標本殘端切緣，經(jīng)病理證實為正常腸組織，共45例。全部病例都是原發(fā)性腫瘤，且術前未行新輔助放化療及免疫治療。結直腸癌組織中，男57例，女33例，年齡36～74（55.0±2.6）歲；正常結直腸組織中，男28例，女17例，年齡39～71（56.0±2.1）歲；2組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義。

1.2 免疫組織化學方法及試劑

鼠抗人單克隆濃縮型Caveolin-1抗體（克隆號ab40278 R3-5G4）購于香港Abcam公司；鼠抗人單克隆D2-40抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

將部分取材標本速凍于液氮中，之后于-80℃保存；標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，厚3 μm。隨后行HE染色，光鏡下觀察記錄后作出病理診斷。切片于80℃烤箱烤30 min；然后脫水，枸櫞酸緩沖液于140℃高壓修復抗原，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶；PBS洗3次，加一抗，4℃孵育過夜；PBS洗3次，加二抗，室溫孵育20min；DAB工作液顯色，顯微鏡下觀察，蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分化、流水沖洗、梯度乙醇脫水及松節(jié)油透明，最后樹膠封片。陰性對照以PBS代替一抗，陽性對照則為已知的陽性片。

1.3 陽性結果的判定標準

1.3.1 Caveolin-1表達的判定 細胞質內和（或）細胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞，結果判定借鑒Dorudi等［6］方法，綜合考慮染色水平和陽性細胞數(shù)：陽性細胞所占百分比≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞76%為4分；觀察著色水平并記錄分值，無著色：0分，淺黃色：1分，黃色：2分，深黃色：3分。兩者相乘，0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），9～12分為（+++），（+）～（+++）均視為陽性。

1.3.2 LMVD檢測 D2-40標記并計數(shù)LMVD，其陽性表達為棕黃色顆粒，定位于淋巴管內皮細胞的胞質和（或）胞膜。先于40倍視野選出熱點區(qū)（4個脈管最密集的區(qū)域），然后于400倍視野將著色的單個及成簇的內皮細胞記為微淋巴管，并隨機計數(shù)5個視野的微淋巴管數(shù)，取其平均值即為LMVD值。由2名病理高年資主治醫(yī)師單獨閱片后一并得出判定結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用百分率表示，采用χ2檢驗，計量資料用±s表示，采用t檢驗，假設檢驗水平α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Caveolin-1蛋白表達及LMVD值

結直腸癌組織中Caveolin-1蛋白的陽性表達率（73.33%，66/90）明顯高于正常結直腸組織（11.11%，5/45），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=33.56，P=0.000），見圖1。結直腸癌組織中LMVD值（18.25±2.36）明顯高于正常結直腸組織（3.14± 1.58），差異有統(tǒng)計學意義（t=32.00，P=0.000）。進一步相關分析顯示，Caveolin-1的表達與LMVD值具有明顯相關性（r=0.874，P=0.000）。

2.2 Caveolin-1蛋白的表達水平及LMVD值與臨床病理參數(shù)間的關聯(lián)

Caveolin-1蛋白的表達水平及LMVD值與患者腫瘤大小、分化程度、組織學類型、病變部位等臨床病理參數(shù)無相關性（P均＞0.05），而與腫瘤浸潤深度、肝轉移、淋巴結轉移、腫瘤TNM分期相關（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

2.3 Caveolin-1在結直腸腺癌組織中的表達與LMVD的關聯(lián)

在結直腸癌組織中，Caveolin-1表達陽性組LM-VD值（17.81±2.15）明顯高于陰性組（6.15± 2.21），差異有統(tǒng)計學意義（t=21.42，P=0.000）。

圖1 不同組織中Caveolin-1的表達（免疫組化×400）

3 討論

Caveolin-1基因定位于染色體7q31上，系Caveolin-1家族成員之一，有α和β2個亞型，含有178個氨基酸殘基，相對分子質量為22 000。Caveolin-1具有特殊的結構域，高度保守的疏水性氨基酸殘基形成發(fā)夾結構嵌入細胞膜內，親水的N端和C端分別位于細胞質兩側，N端氨基酸內含與多種信號分子活化中心相似的Caveolin結合序列，即Caveolin-1腳手架區(qū)（Caveolin-1 saffolding domain，CSD），能特異性地結合多種細胞信號蛋白，如G蛋白亞單位、Src、Fyn、HA2Ras、EGF受體、胰島素受體、eNOS、PKC等，抑制其相關的作用及活性，并形成多條信號傳導通路的樞紐，在細胞增殖、分化、遷移和凋亡等方面起重要的調控作用［7-8］。其C末端區(qū)域內含Tyr14磷酸化位點，Ab1、Frn、Src等酪氨酸激酶能使Tyr14位點磷酸化，在胞內信號的轉導、細胞吞噬、遷移和黏附等過程中起調控作用［9］。此外，Caveolin-1能夠抑制Ras/ERK、MAPK/ERK激酶系統(tǒng)，介導細胞過度增殖和凋亡，促進腫瘤細胞形成［10］；Caveolin-1還可通過Ras-GRF1、P13K/Akt等途徑致細胞周期停滯，誘導細胞凋亡。

表2 結直腸癌組織中Caveolin-1、LMVD的表達與臨床病例參數(shù)間的關系

本研究結果顯示，Caveolin-1在結直腸腺癌組織中的陽性表達率高于正常結腸癌組織；且結直腸癌組織中Caveolin-1表達陽性組LMVD值明顯高于陰性組，提示Caveolin-1蛋白高表達可能與結直腸腺癌的浸潤、淋巴結轉移密切相關。進一步研究顯示，Caveolin-1陽性表達組LMVD值明顯高于陰性組，考慮Caveolin-1在結直腸癌中可誘導淋巴管生成，增加腫瘤內LMVD，從而增強腫瘤的浸潤性和侵襲力。

本實驗結果顯示，Caveolin-1蛋白表達與患者腫瘤大小、組織學類型、分化程度、病變部位等臨床病理參數(shù)無關，而與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、肝轉移、腫瘤的TNM分期有關，這與楊勝蘭等［11］研究結果大致相同；同樣，LMVD值與患者腫瘤大小、組織學類型、分化程度、病變部位等臨床病理參數(shù)無關，而與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、肝轉移、腫瘤的TNM分期有關，這與徐衛(wèi)國等［12］的研究結果基本一致。

綜上所述，Caveolin-1和LMVD是結直腸癌患者的獨立預后指標，通過檢測結直腸癌患者Caveolin-1水平和LMVD值有助于判斷腫瘤的惡性程度，從而指導臨床診療；然而Caveolin-1促進腫瘤淋巴管生成的具體機制目前尚不明確，尚需進一步研究。

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Correlation of Caveolin-1 expression w ith m icrolym phatic density in colorectal adenocarcinoma tissues and its clinical significance

GUO Fei，XUE Jun，WU Xue-liang，YU Hong-feng，QU Ming，ZHANG Peng-cheng，SUN Guang-yuan，HU Xiao-feng，WANG Li-kun
（Department of Vascular Gland Surgery，the First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou Hebei075000，China）

Objective：To study the expression of Caveolin-1 in colorectal adenocarcinoma tissues and its correlation with microlymphatic density（LMVD），and to investigate the clinical pathological prognostic significance of Caveolin-1 and LMVD in patientswith colorectal cancer.M ethods：The expression of Caveolin-1 and LMVD in 45 specimens of normal colorectal tissues，and 90 specimens of colorectal adenocarcinoma tissueswere detected by immunohistochemistry technique.We also investigated the correlation between their expression and the clinicopathologic tissues features.ResultsThe positive rates of Caveolin-1 in colorectal adenocarcinoma（73.33%）were significantly higher than those in normal colorectal tissues（11.11%，P＜0.01）；The positive rates of LMVD in colorectal adenocarcinoma tissues（18.25±2.36）were significantly higher than those in normal colorectal tissues（3.14±1.58，P＜0.01）.Expression of Caveolin-1 and LMVD value was correlated with liver metastasis，lymph node metastasis，TNM stage and the depth of tumor invasion.Themean LMVD in group with Caveolin-1 positivity expression was significantly higher than in that with Caveolin-1 negativity expression.Conclusion：The expression of Caveolin-1 in colorectal cancer was closely related to lymphaticmicrovessel of tumor，and its expression and LMVD were independent prognostic indicators for patientswith colorectal cancer.

colorectal neplasms；Caveolin-1；microlymphatic density；immunohistochemistry

郭飛（1981—），男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事乳腺及消化系惡性腫瘤的基礎與臨床診療；薛軍（通訊作者），主任醫(yī)師，E-mail：yfyxuejun@163.com

R735.3 ［文獻標志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0225-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150015

張家口市科技局2013指令性計劃（1311055D）

2015-01-27 ［編輯］劉星星