JNK/c-Jun信號通路參與介導(dǎo)EB病毒編碼的BARF1基因上調(diào)胃癌細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)

張宇瓊，張雪怡，徐美琴，褚福營，成靜，陳巧林，周天戟

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

JNK/c-Jun信號通路參與介導(dǎo)EB病毒編碼的BARF1基因上調(diào)胃癌細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)

張宇瓊，張雪怡，徐美琴，褚福營，成靜，陳巧林，周天戟

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：探討EB病毒編碼的BARF1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞JNK-MAPK信號通路活性及Bcl-2基因表達(dá)的影響。方法：以pSG5空載體轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞系BGC823（BGC-SG）為對照，采用蛋白質(zhì)印跡分析穩(wěn)定表達(dá)BARF1的BGC823細(xì)胞（BGC-BARF1）中，以及采用JNK-MAPK的特異性抑制劑SP600125處理后JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平以及c-Jun和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與BGC-SG相比，BGC-BARF1細(xì)胞中JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平，以及c-Jun和Bcl-2蛋白的表達(dá)均顯著提高（P＜0.05）。SP600125處理后，c-Jun蛋白的磷酸化水平以及c-Jun和Bcl-2蛋白的表達(dá)均顯著下降。結(jié)論：JNK/c-Jun信號通路參與介導(dǎo)BARF1上調(diào)胃癌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)。

BARF1；EB病毒；胃癌；JNK；Bcl-2

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬于γ-皰疹病毒亞科，1964年由Epstein和Barr首次從非洲兒童的淋巴瘤細(xì)胞中分離得到。研究表明，EB病毒是一種致瘤性病毒，與其相關(guān)的惡性腫瘤包括鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）、胃癌（gastric carcinoma，GC）、伯基特淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma，BL）和霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s disease，HD）。EB病毒陽性的胃癌稱為EB病毒相關(guān)胃癌，約占全球胃癌的10%［1-3］，但EB病毒在其中的作用還不是十分清楚，普遍認(rèn)為與病毒編碼的蛋白密切相關(guān)。BARF1是EB病毒編碼的一個(gè)癌基因，存在于幾乎所有的EB病毒相關(guān)胃癌中，具有抑制上皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其永生化和轉(zhuǎn)化的作用［1，4-5］。轉(zhuǎn)錄激活因子激活蛋白-1（AP-1）主要是由c-Fos和c-Jun組成的異二聚體復(fù)合物，其中c-Jun是最重要的轉(zhuǎn)錄因子。作為一個(gè)癌蛋白，c-Jun在調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和凋亡方面起關(guān)鍵作用。作為c-Jun轉(zhuǎn)錄因子的上游信號，JNK（c-Jun氨基末端激酶）-MAPK信號通路不僅可以在蛋白水平促進(jìn)c-Jun的表達(dá)，而且激活的MAPK信號通路還可使c-Jun蛋白發(fā)生磷酸化，從而極大地提高c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性，因而是細(xì)胞凋亡和生長控制的主要信號途徑。Kume等［6］發(fā)現(xiàn)EB病毒相關(guān)胃癌組織中存在細(xì)胞凋亡抑制和Bcl-2蛋白的過表達(dá)。Sheng等［5］研究表明，BARF1能夠激活Bcl-2蛋白過表達(dá)從而抑制凋亡。而Wang等［3］發(fā)現(xiàn)，BARF1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞c-Jun的表達(dá)。因此，我們提出假說認(rèn)為，BARF1通過激活JNK-MAPK信號通路上調(diào)胃癌細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá)，本研究旨在對其進(jìn)行證偽。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

人胃癌細(xì)胞系BGC823購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，pSG5載體以及pSG5-BARF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆BGC-SG和BGC-BARF1各3個(gè)，由本室構(gòu)建與保存，經(jīng)RT-PCR鑒定，BARF1表達(dá)正常。DMEM、胎牛血清（Gibco公司），兔抗JNK、p-JNK、c-Jun、pc-Jun、Bcl-2抗體（Bioworld公司），RIPA裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、鼠抗β-肌動蛋白抗體，JNK特異性抑制劑SP600125（碧云天生物技術(shù)研究所），濕式電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和Quantity One圖像分析軟件（Bio-Rad公司），PVDF膜（Millipore公司），化學(xué)發(fā)光成像分析儀ImageQuant LAS 4000（GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將BGC-SG和BGC-BARF1置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM中，培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。2～3 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞長至75%左右，用含0.1%胰酶的PBS消化傳代。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)至密度為75%左右，抑制實(shí)驗(yàn)則換加含50μmol/ L的SP600125或DMSO繼續(xù)培養(yǎng)12 h。用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白后，采用12%的凝膠進(jìn)行SDS-PAGE，再以300 mA恒流轉(zhuǎn)印至PVDF膜。以含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h。分別加入兔抗Bcl-2、c-Jun、p-c-Jun、JNK1/2/3及p-JNK1/2/3抗體（1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜，次日以TBST洗3次，10 min/次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶4 000稀釋），室溫孵育1 h，TBST洗3次，10 min/次，加入ECL顯色液于化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影。PVDF膜洗去一抗及二抗后，重新與β-肌動蛋白抗體（1∶4 000）及HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（1∶5 000）反應(yīng)。顯影圖像以Quantity One軟件分析蛋白條帶密度值，經(jīng)β-肌動蛋白校正上樣量后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism（Version 5.0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BARF1激活胃癌細(xì)胞中JNK/c-Jun信號通路

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，BGC-BARF1細(xì)胞中c-Jun的蛋白表達(dá)、c-Jun和JNK蛋白的磷酸化水平均顯著高于BGC-SG對照（t=9.561，4.269和4.331，P＜0.05），而總JNK無顯著變化（圖1、圖2）。采用SP600125處理BGC-BARF1細(xì)胞后，c-Jun蛋白的表達(dá)和磷酸化水平均顯著下降（t=5.098和5.782，P＜0.05），見圖3。

2.2 JNK/c-Jun信號參與介導(dǎo)BARF1上調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，BGC-BARF1細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著高于BGC-SG細(xì)胞（t=3.386，P＜0.05），見圖4 A、B。采用SP600125處理后，BGC-BARF1細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著下降（t=3.349，P＜0.05），見圖4 C、D。

圖1 BGC-BARF1細(xì)胞中c-Jun蛋白的表達(dá)和磷酸化水平

圖2 BGC-BARF1細(xì)胞中JNK蛋白的磷酸化水平

3 討論

BARF1基因位于EB病毒基因組的BamHI-A片段內(nèi)，編碼一個(gè)含221個(gè)氨基酸、相對分子質(zhì)量為（29～33）×103的分泌蛋白。研究表明，BARF1基因可促進(jìn)人胃癌細(xì)胞和永生化上皮細(xì)胞的增殖［2，7］。多項(xiàng)研究證實(shí)BARF1通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)而抑制細(xì)胞的凋亡［3，6］，但其機(jī)制尚不十分清楚。我們最近的研究結(jié)果顯示，BARF1可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路上調(diào)Bcl-2的表達(dá)而抑制鼻咽癌細(xì)胞的凋亡［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，BARF1能促進(jìn)胃癌細(xì)胞c-Jun蛋白的磷酸化。c-Jun的磷酸化可增強(qiáng)其與其他轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體后的轉(zhuǎn)錄活性。由于c-Jun的磷酸化最先觸發(fā)了AP-1的激活，AP-1又能反過來激活c-Jun的啟動子從而促進(jìn)其表達(dá)［9］，故而我們發(fā)現(xiàn)c-Jun蛋白的表達(dá)水平也顯著增加。

圖3 SP600125處理后BGC-BARF1細(xì)胞中c-Jun蛋白的表達(dá)和磷酸化水平

圖4 BGC-BARF1細(xì)胞中以及SP600125處理后Bcl-2蛋白的表達(dá)

AP-1蛋白是由亮氨酸拉鏈（basic region-leucine zipper，bZIP）蛋白組成的同源或異源二聚體，在哺乳動物中主要由Jun家族成員如c-Jun、JunB和Fos家族成員如c-Fos、FosB等組成。AP-1蛋白通過與靶基因的DNA結(jié)合而激活其轉(zhuǎn)錄活性，參與細(xì)胞增殖、凋亡與分化，以及免疫炎癥反應(yīng)與腫瘤形成等一系列病理生理過程［9］。c-Jun是AP-1家族的基本成員，同時(shí)也是最強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄激活因子。c-Jun/AP-1蛋白作為一個(gè)癌蛋白在卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、子宮頸癌及肺癌等多種腫瘤中都呈過表達(dá)狀態(tài)［10-11］，并已被證明對肝癌和皮膚癌的發(fā)展起決定性作用［12-13］。c-Jun的活性受多種因素的調(diào)節(jié)，其中，JNK能夠與c-Jun的特定轉(zhuǎn)錄激活序列結(jié)合而促使其磷酸化。JNK是MAPK家族成員之一，屬于高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。JNK蛋白激酶由3個(gè)同源性基因編碼：JNK1、JNK2和JNK3，這些基因通過選擇性剪接產(chǎn)生了10種異構(gòu)體，這些異構(gòu)體的共同基序是蘇氨酸-脯氨酸-酪氨酸（T-PY），與其激活有關(guān)。當(dāng)受到外界刺激時(shí)，MEKK4/ JNKK1和MEK7/JNKK2可介導(dǎo)JNK的Thr183和Tyr185磷酸化而激活JNK，使其具有酶催化活性［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，BARF1能夠通過提高胃癌細(xì)胞中JNK的磷酸化水平而激活JNK/MAPK信號通路。激活的JNK能夠促使c-Jun轉(zhuǎn)錄因子Ser73和Ser63位點(diǎn)的磷酸化，從而提高其轉(zhuǎn)錄活性。活化后的c-Jun參與形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)參與調(diào)控多種蛋白。當(dāng)加入JNK1/2/3的特異性抑制劑SP600125后，c-Jun蛋白的表達(dá)和磷酸化水平均顯著下降，提示JNK受BARF1激活后可促進(jìn)c-Jun蛋白的合成以及磷酸化修飾，增強(qiáng)了AP-1的活性，以及下游靶基因的表達(dá)。

Bcl-2是Bcl-2蛋白家族中最重要的抗凋亡成員，能保護(hù)細(xì)胞免受凋亡，從而增加細(xì)胞染色體畸變和病毒感染的機(jī)會，導(dǎo)致細(xì)胞惡變和腫瘤形成。在前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、腎癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、急慢性白血病以及皮膚癌等多種人類腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了Bcl-2的異常表達(dá)［15-16］。本研究中，我們在進(jìn)一步證實(shí)BGCBARF1中Bcl-2過表達(dá)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)JNK抑制后，Bcl-2的表達(dá)顯著下降，說明BARF1通過激活JNK/ c-Jun信號通路引起了其下游靶基因Bcl-2的表達(dá)增高。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，JNK/c-Jun信號通路參與介導(dǎo)了BARF1上調(diào)胃癌細(xì)胞原癌基因Bcl-2的表達(dá)，從而抑制了其凋亡。然而，信號通路網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜，是否還有其他信號通路參與介導(dǎo)了BARF1誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡抑制以及增殖的過程，還有待于進(jìn)一步研究。

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JNK/c-Jun signaling pathway contributes to mediate Epstein-Barr virus-encoded BARF1 gene up-regulating Bcl-2 expression in human gastric carcinoma cells

ZHANG Yu-qiong，ZHANG Xue-yi，XU Mei-qin，CHU Fu-ying，CHENG Jing，CHEN Qiao-lin，ZHOU Tian-ji
（School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the effect of the JNK/c-Jun signaling pathway on mediating Epstein-Barr virus-encoded BARF1 gene up-regulating Bcl-2 expression in human gastric carcinoma cells.M ethods：Western blotting was performed to analyze the levels of JNK and c-Jun protein phosphorylations and of the total c-Jun and Bcl-2 protein expressions in BARF1-stably-expressing human gastric carcinoma cell line BGC823（BGC-BARF1）under the control of pSG5 vector transfected one（BGC-SG）.Results：The levels of the JNK and c-Jun protein phosphorylations，and of the c-Jun and Bcl-2 protein expressions were significantly increased in BGC-BARF1 compared with the BGC-SG controls，and blocked by special inhibitor of JNK-MAPK SP600125（all P＜0.05）.Conclusion：JNK/c-Jun signaling pathway contributes to mediate BARF1 gene up-regulating the Bcl-2 expression in human gastric carcinoma cells.

BARF1；Epstein-Barr virus；gastric carcinoma；JNK；Bcl-2

R735.2 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0199-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150046

江蘇大學(xué)高級技術(shù)人才科研啟動基金資助項(xiàng)目（06JDG011）

張宇瓊（1990—），女，碩士研究生；周天戟（通訊作者），教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：zhoutj64@ujs.edu.cn

2015-03-17 ［編輯］ 何承志