TGF-β1介導NF-κB信號通路抑制橫紋肌肉瘤的肌分化

姜珍，陳枉枉，曹丹，黃封博，房建凱，孫莉，孫茂民，王守立

（蘇州大學醫(yī)學部1.解剖學教研室暨細胞神經(jīng)生物學研究室；2.實驗動物中心；3.病理學與病理生理學系，蘇州江蘇215123）

TGF-β1介導NF-κB信號通路抑制橫紋肌肉瘤的肌分化

姜珍1，2，陳枉枉1，2，曹丹3，黃封博3，房建凱3，孫莉1，2，孫茂民2，王守立3

（蘇州大學醫(yī)學部1.解剖學教研室暨細胞神經(jīng)生物學研究室；2.實驗動物中心；3.病理學與病理生理學系，蘇州江蘇215123）

目的：探討TGF-β1介導NF-κB信號通路抑制橫紋肌肉瘤肌分化的分子機制。方法：將構建的TGF-β1siRNA質粒表達系統(tǒng)轉染橫紋肌肉瘤RD細胞株，通過免疫熒光染色法檢測Caspase-3的表達；TUNEL試劑盒檢測RD細胞的凋亡；透射電鏡檢測RD細胞的分化情況；細胞免疫熒光法檢測外源性TGF-β1對RD細胞中NF-κB家族成員p65、p50、p52和RelB表達水平的影響；免疫組化S-P法分別檢測橫紋肌肉瘤石蠟組織中NF-κB家族成員的表達水平。結果：與對照組比較，TGF-β1沉默RD細胞中Caspase3的表達和TUNEL法檢測的陽性細胞數(shù)量明顯增加（P＜0.05）；電鏡結果顯示肌絲結構明顯增加；在外源性TGF-β1（2 ng/mL）作用6 h后，RD中p65、p50的陽性率和陽性強度均明顯高于對照組（P＜0.05）；p65、p50的表達率在TGF-β1高表達橫紋肌肉瘤石蠟組織中明顯高于TGF-β1低表達組（P＜0.05）。結論：橫紋肌肉瘤的分化抑制可能與TGF-β1介導的NF-κB家族成員p65、p50上調有關。

橫紋肌肉瘤；TGF-β1；NF-κB；肌分化

橫紋肌肉瘤細胞可以產生多種生長因子，如轉化生長因子-β1（transforming growth factors-β1，TGF-β1）、胰島素樣生長因子Ⅱ（insulin-like growth factorⅡ，IGFⅡ）、堿性纖維母細胞生長因子和內皮生長因子等，并表達相應受體。其中，TGF-β1與橫紋肌肉瘤分化障礙的關系最為密切。本課題組前期的研究結果顯示［1］，沉默TGF-β1不僅能抑制人橫紋肌肉瘤RD細胞的生長，而且能誘導RD細胞分化，外源性TGF-β1不但能刺激其下游分子Smad4表達增高，也能刺激細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERKs）的表達增高［2］，提示橫紋肌肉瘤高分泌TGF-β1可能通過非Smad途徑參與肌分化障礙調控。

根據(jù)上述研究基礎和近年來關于2-酮戊二酸依賴的雙加氧酶超家族（Egl nine homolog 3，EGLN3）等外源性信號激活核轉錄因子（nuclear factor，NF）-κB的信號通路能抑制成肌細胞分化的研究報道［3-4］，我們推測橫紋肌肉瘤的分化障礙可能與TGF-β1介導NF-κB信號通路有關。本研究觀察了TGF-β1沉默后RD細胞的分化程度與NF-κB家族成員表達水平的相關性，以及橫紋肌肉瘤石蠟組織中TGF-β1表達和NF-κB家族成員的表達水平的相關性，以為TGF-β1信號通路參與橫紋肌肉瘤分化障礙的形成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉染介質Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；Trizol試劑（Sigma公司）；p65、p50、p52、RelB等抗體（Santa Cruz公司）；兔抗Caspase-3多克隆抗體和FITC標記山羊抗兔IgG（武漢博士德生物技術公司）；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；免疫組織化學S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；胎牛血清和DMEM分化培養(yǎng)基（Gibico公司）；TGF-β1siRNAs表達載體由蘇州大學醫(yī)學部分子病理實驗室構建［5］；人橫紋肌肉瘤RD細胞株（美國ATCC）；53例胚胎型橫紋肌肉瘤石蠟組織（四川大學華西醫(yī)學院和蘇州大學附屬醫(yī)院）。

1.2 方法

1.2.1 TGF-β1沉默RD細胞系的建立 RD細胞常規(guī)培養(yǎng)至細胞生長達到對數(shù)期，制備濃度為1× 106/mL RD細胞懸液，以每孔200μL接種于24孔培養(yǎng)板中，再加完全培養(yǎng)基800μL，24 h細胞貼壁后，待其細胞單層鋪滿80%左右，轉染TGF-β1siRNA，37℃，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)6 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基。

轉染的細胞培養(yǎng)24 h后，將G418濃度分別設定為100，200，300，400，500，600，700，800，900和1 000 g/mL，每個濃度重復3個孔。以1周內致使細胞全部死亡的G418最低濃度篩選上述載體轉染的RD細胞，2周后挑取細胞克隆于24孔板中擴增，即獲得穩(wěn)定轉染的細胞系。

1.2.2 免疫熒光染色法檢測TGF-β1沉默RD細胞的凋亡

1.2.2.1 細胞免疫熒光法檢測TGF-β1沉默RD細胞中Caspase-3的表達 將上述TGF-β1沉默RD細胞系在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細胞達到對數(shù)期后，制備細胞懸液（4×104/mL），500μL/孔接種于加有小圓玻片的24孔培養(yǎng)板中。細胞爬片后，取出小圓玻片用預冷的PBS漂洗5 min×3次，4%低聚甲醛4℃固定15 min，0.3%TritonX-100 PBS漂洗5 min，PBS洗5 min×3次，5%BSA封閉30 min。抗體（Caspase-3，1∶150稀釋度）滴于Parafilm膜上，夾出玻片正面朝下，倒扣于抗體上，4℃孵育過夜。PBS洗玻片5 min，滴加FITC標記山羊抗兔IgG（1∶100），37℃孵育1 h，PBS洗3×5 min，將小圓玻片倒扣于滴有抗熒光淬滅封片液的載玻片上，封片，熒光顯微鏡隨機視野觀察，每張玻片至少觀察200個細胞，計數(shù)FITC陽性細胞，每次實驗都設對照組，并重復3次。

1.2.2.2 TUNEL試劑盒檢測RD細胞的凋亡 將上述TGF-β1沉默RD細胞系培養(yǎng)于加有小圓玻片的24孔培養(yǎng)板中，細胞爬片后，取出玻片，PBS洗滌1次，室溫晾干，用4%低聚甲醛固定細胞30 min，用PBS洗滌1次，加入含0.1%Triton X-100的PBS，冰浴孵育2 min，用PBS洗滌2次，按照說明書配制適量的TUNEL檢測液，充分混勻，在每個小圓玻片上分別加50μL TUNEL檢測液（TdT酶2μL，熒光標記液48μL），37℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。每一玻片至少觀察200個細胞，計數(shù)FITC陽性細胞，每次實驗都設對照組，并重復3次。

1.2.3 透射電鏡觀察RD細胞的肌分化 將上述TGF-β1沉默RD細胞系在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后收集細胞，3%戊二醛預固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡（日立H600型）觀察肌絲結構。

1.2.4 免疫熒光檢測外源性TGF-β1對NF-κB家族各成員核內表達的影響 將RD細胞接種于含有TGF-β1（2 ng/mL）的DMEM中，6 h后用免疫熒光法檢測核內p65、p50、p52和RelB的表達情況，并與對照組比較。具體方法參照“1.2.2.1”。觀察NF-κB家族各成員的陽性率和陽性強度，重復3次取均數(shù)，應用統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 免疫組化S-P法檢測NF-κB家族各成員蛋白表達水平 根據(jù)前期70例橫紋肌肉瘤石蠟組織中TGF-β1表達水平的研究結果［6-7］，將其中53例胚胎型橫紋肌肉瘤分為31例TGF-β1高表達組和22例低表達組。分別檢測NF-κB家族成員的蛋白表達，并分析這些蛋白表達與TGF-β1表達的相關性。p65，p50，p52以及RelB抗體的工作濃度為1∶100。具體步驟：將石蠟組織切片脫蠟水化，3%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液高壓抗原修復，5%正常羊血清封閉非特異性抗原抗體反應，加一抗，37℃孵育30 min，加生物素標記的二抗（1∶200），37℃，30 min，加鏈霉親和素 過氧化物酶復合物（1∶200），37℃，30 min，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。按照每張切片的陽性細胞比例及著色深淺計分，行半定量分析。陽性細胞所占比例判斷標準：無細胞著色為0分，1/3以下細胞著色為1分，1/3～2/3細胞著色為2分，2/3以上細胞著色為3分。陽性強度：無著色0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項積分相乘：0分為-，1～3分為+，4～6分為++，7～9分為+++；將-、+視為低表達，++、+++視為高表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 10.0軟件，兩樣本率的比較使用χ2檢驗，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1沉默后RD細胞凋亡明顯增加

與對照組比較，TGF-β1基因沉默后的RD細胞中Caspase-3的表達和TUNEL實驗的陽性細胞數(shù)量明顯增加（P＜0.05和P＜0.01）。見圖1。

2.2 TGF-β1沉默RD細胞在分化培養(yǎng)過程中肌絲結構逐漸形成

透射電鏡觀察結果顯示，對照組RD細胞胞質未見明顯肌絲結構，而TGF-β1沉默RD細胞在分化培養(yǎng)基中1周后胞質出現(xiàn)明顯的肌絲結構（位于細胞核附近），見圖2。

2.3 外源性TGF-β1促進RD細胞核內p65、p50的表達

細胞免疫熒光檢測結果顯示，RD細胞在外源性TGF-β1的刺激下，p65、p50的陽性率和陽性強度均比對照組明顯增加（P＜0.05），而外源性TGF-β1對RelB、p52的表達無明顯影響。見圖3。

圖1 TGF-β1 siRNA促進RD細胞凋亡

2.4 橫紋肌肉瘤石蠟組織中NF-κB家族成員蛋白的表達

p65、p50表達率在31例TGF-β1高表達組中分別為71.0%和61.3%，均明顯高于22例TGF-β1低表達橫紋肌肉瘤標本（27.3%和22.7%）。而RelB和p52蛋白水平在兩組中無明顯差異（P＞0.05），見表1。

3 討論

橫紋肌肉瘤是較常見的軟組織惡性腫瘤。形態(tài)學或分子遺傳學研究都表明，各類型橫紋肌肉瘤來自于原始間葉細胞的分化，盡管都不同程度地表達肌轉錄因子MyoD家族，卻不能完成終末分化。由于橫紋肌肉瘤低分化類型多見，不僅難以與其他小圓細胞腫瘤相鑒別，而且生長迅速，早期即可發(fā)生血道轉移，手術治療往往難以根治。近年來，雖然多種治療手段的綜合應用使得橫紋肌肉瘤的治愈率大大提高，但術后肢體的功能限制及化療藥物的毒副作用，大大降低了生存者的生活質量［8-9］，尋找新的治療靶點已成為迫切任務［10］。深入探討橫紋肌肉瘤分化障礙的機制有望為開辟新的治療途徑提供理論依據(jù)。

圖2 TGF-β1 siRNA促進RD細胞肌分化（電鏡×6 000）

圖3 外源性TGF-β1對RD細胞中NF-κB家族成員細胞核內表達的影響

表1 橫紋肌肉瘤組織中NF-κB家族各成員高表達與TGF-β1蛋白表達的相關性 例（%）

橫紋肌肉瘤細胞可以產生多種生長因子并表達相應受體。若通過佛波醇（TPA）影響TGF-β1的激活，阻斷其信號轉導可以誘導胚胎型橫紋肌肉瘤RD細胞的肌分化［11］。TGF-β1是多肽類生長因子，依細胞類型、生理環(huán)境不同，可表現(xiàn)出不同的生物學作用。運用TGF-β1反義寡核苷酸能有效抑制橫紋肌肉瘤RD細胞的體內成瘤性［12］，提示在橫紋肌肉瘤中存在TGF-β1信號通路并可能參與肌分化的調控。本研究的結果顯示，TGF-β1沉默后的RD細胞在分化培養(yǎng)1周后Caspase-3的表達和細胞陽性率明顯增加，電鏡觀察可見肌絲結構增加，再次表明沉默TGF-β1可以促進RD細胞的分化。

肌細胞的分化取決于細胞外信號的刺激，如肌原調節(jié)蛋白（MyoD1）和肌細胞生成素（Myogenin）能根據(jù)成肌細胞所處的不同應激條件適應性調整分化狀態(tài)［13］。通過脯氨酸羥化酶EGLN3等外源性信號激活NF-κB能抑制成肌細胞的分化［3］。Bakkar等［14］研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路在肌分化的過程中可能起到一個分子開關的作用，由此推測橫紋肌肉瘤很可能是通過激活NF-κB信號經(jīng)典途徑而抑制肌轉錄因子MyoD家族的合成，后者的變化導致肌分化相關microRNAs（如miR-29）的合成降低，從而導致肌分化障礙［15］。靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與抑制性蛋白IκB結合而存在于胞質中，若在外源性信號刺激下通過信號轉導激活IκB激酶（IKK）上游的激酶而使IKK活化，活化的IKK再使其底物IκB磷酸化，并進一步降解，NF-κB發(fā)生核移位，與靶基因的特異位點結合，從而調控靶基因的轉錄。TGF-β1可通過非Smad途徑即腫瘤壞死因子受體相關因子TRAF-6介導JNK和p38途徑的激活［16］，而TRAF-6是介導NF-κB信號激活的關鍵因子［17］，提示TGF-β1可能通過TRAF介導NF-κB信號經(jīng)典通路的激活。最近的研究顯示，TGF-β1能通過TAK1/ MEK/NF-κB通路促進骨母細胞的存活［18］。為證實橫紋肌肉瘤中TGF-β1與NF-κB信號通路之間可能存在的關系，本研究檢測了外源性TGF-β1對橫紋肌肉瘤RD細胞株NF-κB信號的影響，結果顯示在外源性TGF-β1（2 ng/mL）作用6 h后，RD中p65、p50的陽性率和陽性強度均明顯高于對照組。進一步檢測31例TGF-β1高表達和22例TGF-β1低表達橫紋肌肉瘤石蠟組織，顯示p65、p50的高表達率在TGF-β1高表達橫紋肌肉瘤石蠟組織中明顯高于TGF-β1低表達組，進一步證實了上述推測。

本實驗結果表明，橫紋肌肉瘤分化的抑制可能與TGF-β1介導NF-κB家族成員p65、p50上調有關，但TGF-β1/NF-κB信號通路與肌轉錄因子MyoD家族功能狀態(tài)的關系尚需要進一步研究。

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M echanism of TGF-β1mediated NF-κB signal pathway inhibiting m yogenic differentiation of rhabdom yosarcoma

JIANG Zhen1，2，CHENWang-wang1，2，CAO Dan3，HUANG Feng-bo3，F(xiàn)ANG Jian-kai3，SUN Li1，2，SUN Mao-min2，WANG Shou-li3
（1.Anatomy&Cellular Neurobiology Lab，2.Laboratory Animal Center，3.Department of Pathology，Medical School of Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123，China）

Objective：To investigate the mechanism of TGF-β1mediated NF-κB signal pathway inhibitingmyogenic differentiation of rhabdomyosarcoma（RMS）.M ethods：After transfected with TGF-β1siRNA-expressing plasmid system，the expression level of Caspase-3 were detected by immunohistochemical staining.The apoptosis of RD cellswas assessed by TUNEL assay，and myofilamentwere explored by transmission electron microscope（TEM）.After co-culturing with exogenous TGF-β1，the expression level of nuclear factor-kappa B（NF-κB）familymembers such as p65，p50，p52 and RelB in RD cells were tested by immunofluorescence.The expression level of NF-κB family members in rhabdomyosarcoma paraffin tissues were determined by Immunohistochemistry.Results：Compared with the control group，the expression of Caspase-3 and the positive cells detected by TUNEL assay were increased significantly（P＜0.05）；TEM showed that structure ofmyofilament significantly increased in RD cells treated with TGF-β1siRNA-expressing plasmid system.After6 hours for co-culturing with exogenous TGF-β1（2 ng/mL），RD cells showed significantly higher positive rate and staining intensity of p65 and p50 than those in control group（P＜0.05）.The high expression rate of p65 and p50 was found in TGF-β1-high RMS than that in TGF-β1-low group（P＜0.05）.Conclusion：Differentiation inhibition of rhabdomyosarcomamay be related with the TGF-β1signal transduction mediated by p65 and p50，which is belong to themembers of NF-κB family.

rhabdomyosarcoma；TGF-β1；nuclear factor-κB；myogenic differentiation

姜珍（1989—），女，碩士研究生；陳枉枉（1989—），女，碩士研究生，共同第一作者；孫茂民（通訊作者），副教授，博士，碩士生導師，E-mail：sunmaomin@suda.edu.cn，王守立（共同通訊作者），教授，碩士生導師，E-mail：wangsoly112@hotmail.com

R738.7 ［文獻標志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0190-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140275

國家自然科學基金資助項目（81272738，81372867）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK2011292）；蘇州市應用基礎研究資助項目（SYS201207）

2014-10-21 ［編輯］ 陳海林