水稻紋枯病菌PGs產(chǎn)生與其活性調(diào)控及穩(wěn)定性研究

張瑜

摘 要 胞壁降解酶是水稻紋枯病菌的一個重要致病因子，在眾多胞壁降解酶中以PGs（多聚半乳糖醛酸酶）的活性最高。實驗條件下，紋枯病菌PGs的產(chǎn)生受培養(yǎng)時間、溫度、振蕩條件、C源、葡萄糖濃度及培養(yǎng)液pH的影響，而活性受緩沖液pH和溫度的調(diào)控。以葡萄糖為最適碳源，但在高濃度葡萄糖（≥5%）條件下，PGs的產(chǎn)生受到抑制；在50 ℃，緩沖液pH為5的條件下，PGs活性最高。穩(wěn)定性測定表明，其對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高熱、氯仿、紫外線、胰蛋白酶和蛋白酶K等均不穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞 水稻紋枯病菌；多聚半乳糖醛酸酶；活性調(diào)控；穩(wěn)定性

中圖分類號：S435.111.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號：1673-890X（2015）18-0-03

植物病原真菌在侵入寄主植物過程中可以產(chǎn)生胞壁降解酶（Cell-wall degrading enzymes，CWDEs），這些胞壁降解酶不僅可以分解寄主細(xì)胞壁以提供給真菌生長足夠的養(yǎng)分，還有助于真菌侵入和在寄主體內(nèi)擴(kuò)展。據(jù)其分解底物的不同，胞壁降解酶可分為果膠酶（Pectic enzyme）、纖維素酶（Cellulase）、半纖維素酶（Hemicellulase）和其它酶類。果膠酶根據(jù)作用方式不同，又可分為水解酶和裂解酶兩大類，水解酶包括：多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（Pectin methylgalacturonase，PMG）、果膠甲酯酶（Pectin methylesterase，PME）和一些其它酶，而PG是病菌接觸寄主后產(chǎn)生的第一個胞壁降解酶。

水稻紋枯病菌在人工培養(yǎng)條件和水稻病組織內(nèi)均能產(chǎn)生多種胞壁降解酶，如PG、PMG、Cx、PGTE和PMTE等，其中以PG的活性最高。陳夕軍[1]等認(rèn)為，水稻紋枯病菌產(chǎn)酶的最適條件為在改良的Marcus培養(yǎng)液中，pH為5.0，28 ℃條件下，培養(yǎng)6 d。陳捷[2]等研究了玉米紋枯病菌的產(chǎn)酶種類發(fā)現(xiàn)，除形成上述幾種胞壁降解酶外，該菌還可產(chǎn)生PME，但各種酶的活性與水稻紋枯病菌胞壁降解酶活性均處于同一數(shù)量級。本研究對水稻紋枯病菌PG的產(chǎn)生與活性調(diào)控以及穩(wěn)定性進(jìn)行進(jìn)一步研究，旨在為研究其性質(zhì)及病害的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻紋枯病菌：YN-7，由本實驗室從江蘇水稻紋枯病病株分離保存。

1.2 RsPG的生物活性測定[3]

1.2.1 粗酶的制備

用內(nèi)徑5.0 mm打孔器在PSA培養(yǎng)基上生長的病菌菌落邊緣打孔，挑取5塊菌絲塊至50 mL改良的Marcus培養(yǎng)液中，28 ℃下培養(yǎng)6 d。雙層紗布過濾除去菌絲，4 ℃下12 000 rpm離心20 min，上清即為粗酶液。將粗酶液冰浴，慢慢加入等體積的冷丙酮（-20 ℃），輕輕攪拌，1 h后4 ℃下10 000 rpm離心15 min，收集沉淀，并用0.02 mol/L，pH為8.0的Tris-HCl透析（截留分子量8.0 kDa，下同）過夜后，冷凍干燥，即得粗酶。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)糖曲線的繪制

精確稱取1.000 g多聚半乳糖醛酸，用pH為5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液（磷酸鹽液：Na2HPO4·12H2O 71.62 g溶于蒸餾水，并容至1 000 mL；檸檬酸液：C6H8O7·H2O 21.01 g溶于蒸餾水，并定容至1 000 mL；將磷酸鹽液與檸檬酸液按10.3∶9.7 混合，即得pH為5.0的磷酸—檸檬酸緩沖液）溶解并定容至1 000 mL，即得1 mg/mL多聚半乳糖醛酸溶液[4]。

取9支試管編號，按表1加入各種試劑，在混合振蕩器上振蕩均勻，在沸水浴中加熱5 min。取出后立即用流水冷卻，加蒸餾水定容至25 mL（以1號試管作為空白調(diào)零）。在540 nm處測定各管吸光度。以O(shè)D540縱坐標(biāo)，多聚半乳糖醛酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)樣的配制

試劑 試管號

1 2 3 4 5 6 7 8 9

半乳糖醛酸/（mg/mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

蒸餾水/mL 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4

DNS/mL 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

1.2.3 RsPG酶活力測定

于甲、乙兩支25 mL比色管中分別加入果膠底物5 mL，在50 ℃水浴中預(yù)熱5 min。

于甲、乙管中分別加4 mL磷酸-檸檬酸緩沖液，甲管中加入1 mL酶液（10 mg/mL，下同），立即搖勻，在50 ℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30 min，立即給乙管中加1 mL酶液，立即放入沸水浴中煮沸5 min，終止反應(yīng)，冷卻。

分別取甲、乙管中反應(yīng)液2 mL于兩支25 mL比色管中，再分別給甲、乙管加2 mL蒸餾水，5 mL DNS 試劑，混合，沸水浴煮沸5 min，取出，立即冷卻。加蒸餾水定容到25 mL。3 600 rpm離心8 min，取上清液，以標(biāo)準(zhǔn)空白為基準(zhǔn)調(diào)零，在540 nm處測吸光度（吸光度要在0.025～0.843，否則重新稀釋）。酶活力單位為1 mg酶液在50 ℃、pH為5.0條件下，1 h分解果膠產(chǎn)生1 mg半乳糖醛酸為一個酶活單位。酶活力計算：

式中：A甲為酶樣吸光度；A乙為酶空白樣的吸光度；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率； Dr為稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間/h。

1.3 RsPG產(chǎn)生的調(diào)控

1.3.1 糖種類對RsPG產(chǎn)生的調(diào)控

分別以1.0%果膠、多聚半乳糖醛酸、葡萄糖、淀粉和石耳素等為碳源，測定不同碳源條件下水稻紋枯病菌產(chǎn)生RsPG的能力。

1.3.2 不同濃度葡萄糖對RsPG產(chǎn)生的調(diào)控

在改良的Marcus培養(yǎng)液中加入0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%的葡萄糖，測定不同葡萄濃度下水稻紋枯病菌產(chǎn)生RsPG的能力。

1.3.3 不同pH對RsPG產(chǎn)生的調(diào)控

將培養(yǎng)液pH分別調(diào)為2、3、4、5、6、7、8、9、10，測定不同pH條件下水稻紋枯病菌產(chǎn)生RsPG的能力。

1.4 RsPG反應(yīng)的最適條件

1.4.1 不同溫度下的酶反應(yīng)活性

分別在20、30、40、50、60 ℃反應(yīng)條件下，測定RsPG酶活力，除溫度外，其它操作同1.2.1。

1.4.2 不同pH條件下的酶反應(yīng)活性

分別調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH為2、3、4、5、6、7、8、9和10，測定RsPG酶活力，其它操作同1.2.1。

1.5 RsPG的穩(wěn)定性測定

1.5.1 對熱穩(wěn)定性測定

取5 mL 蛋白液于小試管中，分別置于40、60、80、100 ℃條件下水浴20 min，以室溫處理為對照。用DNS法在540 nm處測定酶活，設(shè)對照的酶活性為100%。

1.5.2 對酸堿穩(wěn)定性測定

將蛋白液調(diào)至不同的pH值，用DNS法在540 nm處分別測定各處理的酶活，設(shè)對照的酶活性為100%。

1.5.3 對紫外線穩(wěn)定性測定

將20 mL蛋白液置于無皿蓋的培養(yǎng)皿中，在20 W紫外光下，距離40 cm照射12 h，以不照射為對照。用DNS法在540 nm處測定酶活，設(shè)對照的酶活性為100%。

1.5.4 對氯仿穩(wěn)定性測定

將蛋白液與等量氯仿混合振蕩1 h，分層后取上層水相，待殘留氯仿?lián)]發(fā)后，用DNS法在540 nm處測定酶活，以未處理蛋白液為對照，設(shè)對照的酶活性為100%。

1.5.5 對蛋白酶穩(wěn)定性測定

取5 mL蛋白液于小試管中，分別加入胰蛋白酶和蛋白酶K，終濃度均為1 mg/mL，37 ℃水浴處理1 h，以不加蛋白酶為對照。用DNS法在540 nm處測定酶活，設(shè)對照的酶活性為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 RsPG產(chǎn)生的調(diào)控

2.1.1 不同糖種類對RsPG產(chǎn)生的調(diào)控

在改良的Marcus培養(yǎng)液中加入不同糖作碳源，水稻紋枯病菌產(chǎn)生PG的量有明顯差異。其中，以1%葡萄糖作碳源產(chǎn)酶量最高，為402.42 U/mL；魔芋粉和多聚半乳糖醛酸次之；而以果膠和淀粉作碳源產(chǎn)量最低，僅為146.06 U/mL和121.82 U/mL。

2.1.2 不同葡萄糖濃度對RsPG產(chǎn)生的調(diào)控

向改良Marcus培養(yǎng)液中分別加入0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%的葡萄糖作碳源，結(jié)果表明，葡萄糖濃度變化對水稻紋枯病菌PG的產(chǎn)生有顯著影響。當(dāng)葡萄糖濃度<2.0%時，隨著葡萄糖濃度的增加，PG的產(chǎn)生量增大；2.0%時，病菌產(chǎn)酶量最高，酶活為404.85 U/mL；當(dāng)葡萄糖濃度>2.0%時，隨著葡萄糖濃度的增加，PG的產(chǎn)生量急劇降低，這與前人發(fā)表的高濃度葡萄糖抑制病原真菌產(chǎn)生PG的觀點一致。

2.1.3 培養(yǎng)液不同pH對RsPG產(chǎn)生的調(diào)控

配制改良Marcus培養(yǎng)液時，將其原始pH分別調(diào)為2、3、4、5、6、7、8、9、10，滅菌后接入菌絲塊。結(jié)果表明，培養(yǎng)液的pH對水稻紋枯病菌產(chǎn)生PG的能力有顯著影響。pH為5.0時，水稻紋枯病菌產(chǎn)生的PG酶活性最高，為412.73 U/mL；低于或高于pH為5.0對其酶活均有較大影響。

2.2 RsPG反應(yīng)的最適條件

2.2.1 溫度對RsPG活性的影響

不同溫度條件下，RsPG分解果膠產(chǎn)生還原糖的能力不同。在50 ℃時，酶活性最高，達(dá)407.88 U/mL，溫度過高或過低都會影響酶的活性。

2.2.2 pH對RsPG活性的影響

不同pH緩沖液條件下，RsPG分解果膠產(chǎn)生還原糖的能力不同。在pH為5時，酶活性最高，達(dá)403.64 U/mL，增加或降低溶液的pH均會降低酶的活性。

2.3 RsPG的穩(wěn)定性

2.3.1 RsPG對溫度的穩(wěn)定性

以未經(jīng)處理的PG為對照，經(jīng)40、60、80 ℃水浴處理的蛋白其活性均有顯著下降，當(dāng)處理溫度為100 ℃時，PG活性完全喪失，說明該蛋白不耐高溫 。

2.3.2 RsPG對酸堿的穩(wěn)定性

PG在pH為4～12范圍內(nèi)均表現(xiàn)有活性，但不同pH值下活性差異極顯著，pH為5時活性最大，pH為3以下活性喪失，表明該蛋白主要存在于酸性條件，但對強(qiáng)酸極敏感。

2.3.3 RsPG對蛋白酶、紫外線和氯仿的穩(wěn)定性

PG對胰蛋白酶、蛋白酶K、紫外線和氯仿均敏感。處理后蛋白活性均有顯著下降，最高只有原來活性的50%左右。

3 結(jié)論與討論

植物病原真菌在致病過程中可產(chǎn)生胞壁降解酶以分

（下轉(zhuǎn)第頁）

（上接第頁）

解植物細(xì)胞壁，PG是病菌接觸寄主后產(chǎn)生的第一個胞壁降解酶。多數(shù)學(xué)者研究表明，PG是一類誘導(dǎo)酶，其在寄主植物體內(nèi)與實驗室離體條件下的表達(dá)情況完全不同，主要是由于寄主組織中存在的一些誘導(dǎo)因子，在合成培養(yǎng)基中并不存在。實驗室條件下，病菌產(chǎn)生PG的能力受培養(yǎng)基組分、外界環(huán)境及分解代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。本實驗室研究表明，水稻紋枯病菌在改良Marcus培養(yǎng)液中，28 ℃，pH為5條件下，靜置培養(yǎng)6 d產(chǎn)PG量最大；同時，PG的產(chǎn)生受底物種類、代謝產(chǎn)物濃度以及培養(yǎng)基起始pH等因子影響。

一般認(rèn)為，真菌PG在pH在3～6的范圍內(nèi)（酸性條件下）活性最大，有些甚至更低。在研究核盤菌與大豆互作過程中病菌產(chǎn)生的PG和草酸之間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，由于病菌在侵染寄主過程中產(chǎn)生草酸，使大豆胚軸組織的pH降低（pH為3.8），從而提高了病菌PG對寄主細(xì)胞壁的分解能力。另外，除個別植物病原真菌PG需求較低或較高的溫度外，其發(fā)揮最佳活性的適宜溫度范圍一般為40～60 ℃。水稻紋枯病菌PG正與其它真菌PG一樣，在偏酸性條件（pH為5）下50 ℃時活性最高。

研究表明，植物病原真菌PG多為單一肽鏈的糖蛋白，其含糖量為5%～10%，少數(shù)含糖量較高。這些糖基化可使PG的蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，提高了其對周圍環(huán)境的抵抗能力，甚至對其酶活都起著關(guān)鍵的作用。寄生疫霉的endo-PG和黑曲霉的exo-PG在去糖基化后，其活性完全喪失，說明糖基化位點可能靠近或就是酶的活性位點。分離純化的水稻紋枯病菌PG的含糖量僅為1.48%，這也可能是其對高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、蛋白酶、紫外線和氯仿等比較敏感的主要原因。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：趙中正）