高脂肪飲食對(duì)大鼠青春期啟動(dòng)影響的實(shí)驗(yàn)研究

矯金玲 陳 華 董逸翔 陶 敏

·論 著·

高脂肪飲食對(duì)大鼠青春期啟動(dòng)影響的實(shí)驗(yàn)研究

矯金玲1陳 華2董逸翔2陶 敏2

目的觀察高脂肪飲食對(duì)大鼠青春期啟動(dòng)的影響。方法20只雌性SD大鼠按配對(duì)設(shè)計(jì)的分組原則，分為標(biāo)準(zhǔn)組、高脂組，各20只。實(shí)驗(yàn)第1天起標(biāo)準(zhǔn)組大鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料，高脂組大鼠喂養(yǎng)高脂肪飼料。每天觀察大鼠陰道口開(kāi)放情況，當(dāng)高脂組大鼠全部出現(xiàn)陰道口開(kāi)放，即于當(dāng)日下午處死全部大鼠。觀察兩組大鼠陰道口開(kāi)放時(shí)間（VO）及第一性周期時(shí)間（D1），計(jì)算子宮、卵巢指數(shù)，采用放射免疫法檢測(cè)血清黃體生成素（LH）的含量。結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)組比較，高脂組陰道口開(kāi)放時(shí)間（VO）（33.2±1.87）天，第一動(dòng)情間期時(shí)間（D1）（35.7±1.16）天，均較標(biāo)準(zhǔn)組的（36.4±0.96）天、（37.5±0.53）天明顯提前（P＜0.01），LH 含量高脂組（6.275±0.422）mIU/mL，標(biāo)準(zhǔn)組（4.979±0.587）mIU/mL，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論高脂肪飲食可促使大鼠青春期啟動(dòng)提前。

大鼠；青春期啟動(dòng)；高脂肪飲食；實(shí)驗(yàn)研究

性早熟是青春期提前的一種典型征象，是一種生長(zhǎng)發(fā)育異常，近年發(fā)病率明顯上升已成為最常見(jiàn)的小兒內(nèi)分泌疾病之一[1]。研究[2]顯示，兒童性成熟年齡的提前主要是外界因素作用的結(jié)果，其中以營(yíng)養(yǎng)等生活條件的改善最為重要。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[3]表明，青春期啟動(dòng)受營(yíng)養(yǎng)因素影響，體質(zhì)量低、攝食減少的營(yíng)養(yǎng)不良大鼠則青春期延遲。隨著生活水平的提高，中國(guó)居民膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生變遷，人們更趨向于消費(fèi)動(dòng)物性食物，脂肪供能比顯著升高[4]。膳食結(jié)構(gòu)中脂肪供能比的增加與兒童性早熟發(fā)病率上升之間有無(wú)因果關(guān)系，目前尚缺乏可靠的臨床及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)增加大鼠飼料中脂肪的供能比，探討高脂肪飲食與大鼠青春期啟動(dòng)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 21日齡清潔級(jí)雌性SD大鼠10窩，購(gòu)買于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)有限公司，合格證號(hào)：2008001601312。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件：溫度18～23℃，濕度60%～80%，每日光照14h。按照配對(duì)設(shè)計(jì)的分配原則，根據(jù)窩別及體質(zhì)量，從中選取20只，分為高脂組10只，飼以高脂肪飼料，標(biāo)準(zhǔn)組10只，飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料。各組大鼠自由攝食及飲水。

1.2 動(dòng)物飼料 動(dòng)物飼料由南通特洛非飼料科技有限公司提供，標(biāo)準(zhǔn)飼料為大鼠生長(zhǎng)期純化型顆粒飼料，按照美國(guó)AIN93G配方標(biāo)準(zhǔn)配制。高脂飼料在標(biāo)準(zhǔn)飼料的基礎(chǔ)上調(diào)整脂肪供能比為45.0%而成[5]。標(biāo)準(zhǔn)飼料成分含量（以1000 g計(jì)）：酪蛋白200 g，玉米淀粉 397.48 g，糊精 132 g，蔗糖 100 g，豆油 70 g，纖維素 50 g，礦物質(zhì) 35 g，維生素 10 g，L-胱氨酸 3 g，氯化膽堿 2.5 g，特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）0.014 g。高脂飼料成分含量（以1000 g計(jì)）：酪蛋白245.41 g，玉米淀粉 318.19 g，蔗糖 100 g，豆油 85.9 g，豬油 147.8g，纖維素 61.35 g，礦物質(zhì) 33.45 g，維生素 0.32 g，L-胱氨酸 3.68 g，氯化膽堿 3.83 g，TBHQ 0.05 g。各組飼料主要營(yíng)養(yǎng)素占總熱卡百分比見(jiàn)表1。

表1 各組飼料主要營(yíng)養(yǎng)素供能比（%）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)第1天（大鼠21日齡）起至大鼠處死日（大鼠36日齡），每日記錄各組大鼠進(jìn)食量，用電子秤測(cè)大鼠體質(zhì)量，用直尺記錄大鼠尾長(zhǎng)。每天9∶00觀察大鼠陰道口開(kāi)放情況，對(duì)陰道口開(kāi)放的大鼠，每日進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片觀察其性周期變化，待高脂組大鼠均出現(xiàn)陰道口開(kāi)放，則于當(dāng)日15∶00處死所有大鼠。實(shí)驗(yàn)第16天（大鼠36日齡）大鼠禁食不禁水5h稱重后，水合氯醛麻醉下腹腔動(dòng)脈取全血4～5mL，離心 3000r/min×10min，吸取上層血清，置于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩４笫笕⊙?，開(kāi)腹，分離周圍結(jié)締組織，取出雙側(cè)卵巢及雙角子宮，子宮遠(yuǎn)端至子宮頸，用電子天平稱重卵巢和子宮濕重。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法 大鼠陰道口開(kāi)放時(shí)間（VO）：待高脂組全部大鼠陰道口開(kāi)放時(shí)（大鼠36日齡），將標(biāo)準(zhǔn)組陰道口未開(kāi)放的大鼠陰道口開(kāi)放時(shí)間記為37日）。大鼠第一性周期時(shí)間（D1）：各組大鼠陰道口開(kāi)放后，每日9∶00做大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片，可觀察到規(guī)則的性周期出現(xiàn)，順序?yàn)閯?dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期。實(shí)驗(yàn)第16天（大鼠36日齡）處死所有大鼠時(shí)，將處死日前陰道口開(kāi)放但未出現(xiàn)第一動(dòng)情間期的D1記為37日，將處死日前仍未出現(xiàn)陰道口開(kāi)放大鼠的D1記為38日。形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)量：根據(jù)器官指數(shù)計(jì)算公式（器官指數(shù)=器官濕重/體質(zhì)量）計(jì)算卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)。血清促黃體生成素（LH）水平采用放射免疫法檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照試劑盒（北京華埠力特生物科技研究所）說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠進(jìn)食量、體質(zhì)量比較 不同飼料組大鼠日均進(jìn)食量比較，大鼠體質(zhì)量、體質(zhì)量增量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量增量、日均進(jìn)食量的比較（g，±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量增量、日均進(jìn)食量的比較（g，±s）

組別標(biāo)準(zhǔn)組高脂組只數(shù)10 10體質(zhì)量增量74.2±4.022 74.4±6.947日均進(jìn)食量88.3±31.229 90.4±32.053

2.2 大鼠陰道口開(kāi)放時(shí)間（VO） 高脂組全部大鼠陰道口開(kāi)放時(shí)（大鼠36日齡），標(biāo)準(zhǔn)組大鼠仍有5只未見(jiàn)陰道口開(kāi)放，與較標(biāo)準(zhǔn)組比較，高脂組大鼠陰道口開(kāi)放時(shí)間提前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3。

2.3 大鼠第一性周期時(shí)間（D1） 各組各期的陰道細(xì)胞涂片表現(xiàn)相同，性周期的持續(xù)時(shí)間大致相同，約4～5天。實(shí)驗(yàn)第16天（大鼠36日齡），高脂組有7只大鼠出現(xiàn)第一個(gè)動(dòng)情間期，標(biāo)準(zhǔn)組無(wú)大鼠出現(xiàn)第一個(gè)動(dòng)情間期。高脂組大鼠第一個(gè)性周期建立的時(shí)間較標(biāo)準(zhǔn)組大鼠顯著提前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠VO、D1時(shí)間比較（d，±s）

表3 各組大鼠VO、D1時(shí)間比較（d，±s）

注：與標(biāo)準(zhǔn)組比較，**P＜0.01

組別標(biāo)準(zhǔn)組高脂組只數(shù)10 10 VO 36.4±0.96 33.2±1.87**D1 37.5±0.53 35.7±1.16**

2.4 臟器指數(shù) 高脂組大鼠子宮、卵巢指數(shù)較標(biāo)準(zhǔn)組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 4。

表4 各組大鼠子宮、卵巢指數(shù)比較（±s）

表4 各組大鼠子宮、卵巢指數(shù)比較（±s）

注：與標(biāo)準(zhǔn)組比較，*P＜0.05

組別標(biāo)準(zhǔn)組高脂組只數(shù)10 10子宮指數(shù)（×10-3）0.975±0.072 1.183±0.134*卵巢指數(shù)（×10-4）4.428±0.784 5.806±0.951*

2.5 各組血清LH水平比較 高脂組大鼠血清LH為（6.275±0.422）mIU/mL，標(biāo)準(zhǔn)組為（4.979±0.587）mIU/mL，高脂組大鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

人類生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持受下丘腦-垂體-性腺軸（HPGA）的控制。青春期啟動(dòng)前HPGA功能處于靜止?fàn)顟B(tài)，下丘腦脈沖發(fā)生器活動(dòng)處于抑制狀態(tài)，從而使性腺處于幼年?duì)顟B(tài)。正常青春期啟動(dòng)時(shí)，隨著下丘腦的成熟，下丘腦脈沖發(fā)生器活動(dòng)增強(qiáng)，HPGA功能激活，下丘腦神經(jīng)元表達(dá)促性腺激素釋放激素（GnRH）水平增加，GnRH脈沖式分泌水平上升、脈沖幅度大、出現(xiàn)晝夜節(jié)律，加之接受刺激的細(xì)胞膜表面受體增加，導(dǎo)致垂體LH和卵泡刺激素（FSH）脈沖式釋放的的頻率和數(shù)量增加，尤其是LH的增加。這種促性腺激素的脈沖式分泌增加了對(duì)性腺的刺激，從而引起性腺發(fā)育，出現(xiàn)性腺活動(dòng)，發(fā)生卵巢排卵，黃體生成，子宮壁增厚，子宮內(nèi)膜出現(xiàn)周期性改變以及出現(xiàn)第二性征和生長(zhǎng)加速[6]。

大鼠HPGA的發(fā)育與人類有相近之處，且性周期短（4～5天），性發(fā)育指征明確，便于觀察，已成為有關(guān)性發(fā)育研究的主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[7]。在大鼠青春前期，HPGA軸功能處于靜止期，使性腺處于幼年?duì)顟B(tài)，青春期啟動(dòng)時(shí)，HPGA軸功能激活，GnRH神經(jīng)元脈沖分泌頻率增加，此時(shí)GnRH神經(jīng)元中GnRH mRNA表達(dá)水平增加，LH、FSH和性腺類固醇激素水平明顯上升[8]，出現(xiàn)陰道口開(kāi)放，陰道脫落細(xì)胞呈周期性改變，規(guī)則的性周期出現(xiàn)是大鼠青春期啟動(dòng)進(jìn)入青春期的表現(xiàn)。同時(shí)卵巢和子宮增重、增大，卵巢發(fā)生排卵，黃體生成，子宮壁增厚。對(duì)大鼠青春期啟動(dòng)的判斷，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，即以陰道口開(kāi)放和第一次排卵的發(fā)生作為判斷雌性大鼠的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)HPGA功能激活時(shí)，LH水平明顯上升，卵巢、子宮增重，血清LH水平、卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)可在一定程度上提示青春期的啟動(dòng)[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與標(biāo)準(zhǔn)組比較，高脂組大鼠陰道口開(kāi)放時(shí)間及出現(xiàn)第一個(gè)動(dòng)情間期時(shí)間明顯提前，大鼠陰道口開(kāi)放后，陰道細(xì)胞涂片均觀察到規(guī)則的性周期，每個(gè)周期持續(xù)約4～5天，按動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期的順序出現(xiàn)。與標(biāo)準(zhǔn)組比較，高脂組大鼠子宮、卵巢指數(shù)增高，血清LH水平增高，達(dá)青春早期水平。以上結(jié)果提示，高脂組大鼠較標(biāo)準(zhǔn)組正常發(fā)育的同齡、同窩、體質(zhì)量相近的大鼠青春期啟動(dòng)提前，而發(fā)育狀況與正常進(jìn)入青春期的大鼠相似，可判定高脂組大鼠HPGA功能激活，大鼠青春期啟動(dòng)提前，至于GnRH神經(jīng)元中GnRH mRNA表達(dá)水平的確切數(shù)值，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩致性早熟的機(jī)制，目前有“臨界體質(zhì)量”學(xué)說(shuō)，即營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩導(dǎo)致體質(zhì)量增加，當(dāng)體質(zhì)量到達(dá)某一臨界時(shí)，出現(xiàn)青春期啟動(dòng)[10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠體質(zhì)量的測(cè)量發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體質(zhì)量及體質(zhì)量增量無(wú)顯著差異。說(shuō)明高脂組大鼠較標(biāo)準(zhǔn)組大鼠青春期啟動(dòng)提前，與體質(zhì)量相關(guān)性不大，提示高脂飲食引起大鼠青春期啟動(dòng)提前，存在“臨界體質(zhì)量”以外的機(jī)制。有學(xué)者認(rèn)為營(yíng)養(yǎng)對(duì)青春發(fā)育的調(diào)控是通過(guò)某些代謝信號(hào)因子將機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的信息傳遞給大腦，各因子相互作用協(xié)同調(diào)控下丘腦分泌GnRH，影響HPGA，從而搭建起營(yíng)養(yǎng)因素與性發(fā)育的關(guān)聯(lián)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，除了瘦素是影響青春期啟動(dòng)的允許因子[11]，與能量代謝有關(guān)的因子如生長(zhǎng)激素釋放肽、生長(zhǎng)激素釋放肽、胰島素樣生長(zhǎng)因子和神經(jīng)肽等均可以作用于生殖軸影響青春期的啟動(dòng)[12]。高脂肪飲食對(duì)HPGA的影響是否通過(guò)代謝信號(hào)實(shí)現(xiàn)，以及通過(guò)哪些代謝信號(hào)，有待進(jìn)一步研究。

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（收稿：2014-04-20 修回：2014-08-20）

Effect of High Fat Diet on the Onset of Puberty of Rats

JIAO Jinling1，CHEN Hua2，DONG Yixiang2，TAOMin2.1 Department of Pediatrics，TCM Hospital of Xiaoshan District，Hangzhou，Hangzhou(311201)，China;2 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou（310053）,China

Objective To investigate the effect of high fat diet on the onset of puberty of rats.MethodsTwenty female SD rats were randomized into standard group and high-fat group by paired design,10 for each group.From the first day of the experiment,rats in standard group were fed with standard diet,rats in high-fat group were fed with high fat diet.When all 10 rats in high-fat group had vaginal opening（VO）,then they were sacrificed on the afternoon of that day.The times of VO and first cycle（D1） were observed,the uterus index and ovarian index were calculated,and the content of serum luteinizing hormone（LH）was detected by radioimmunoassay.ResultsCompared with standard group,VO and D1 was significantly earlier in high-fat group（VO：33.2±1.87d vs 36.4±0.96d；D1：35.7±1.16d vs 37.5±0.53d；all P＜0.01），and the serum LH were statistically increased in high-fat group（6.275±0.422mIU/mL vs 4.979±0.587mIU/mL，P＜0.05）.ConclusionThe high fat diet can induce early puberty starts in rats.

rats；puberty starts；high fat diet；experimental study

p

浙江省教育廳高校科研計(jì)劃（No.20060743）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃（No.2005A073）

1杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院兒科（杭州 311201）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州 310053）

陳華，Tel：18958022829