環(huán)氧合酶—2、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子C在胃癌中的表達(dá)及意義

屈海燕 喬文

[摘要] 目的 探討環(huán)氧合酶-2（COX-2）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及意義。 方法 采用免疫組化SP法檢測COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白在70例胃癌標(biāo)本和30例正常胃黏膜中的表達(dá)情況。 結(jié)果COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白在胃癌細(xì)胞胞質(zhì)中呈棕黃色表達(dá)，表達(dá)率分別為71.4%、62.9%、55.7%，在正常胃黏膜中的表達(dá)率為13.3%、6.7%、16.7%。不同年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小的COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；不同腫瘤TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移的COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；不同病理分級的COX-2蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而VEGF與VEGF-C蛋白的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。COX-2與VEGF、VEGF-C蛋白，VEGF與VEGF-C蛋白在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（P < 0.05）。 結(jié)論 COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，COX-2的表達(dá)與VEGF、VEGF-C的表達(dá)相關(guān)，COX-2可能通過調(diào)節(jié)VEGF、VEGF-C蛋白的表達(dá)從而調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

[關(guān)鍵詞] 胃癌；環(huán)氧合酶-2；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；血管內(nèi)皮生長因子C；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號] R734 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（b）-0016-04

Expression and significance of COX-2， VEGF and VEGF-C in gastric cancer

QU Haiyan1，2 QIAO Wen1

1.Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Medical College of Xi'an Jiaotong University， Shaanxi Province， Xi'an 710061， China； 2.Department of Gastroenterology， Hospital of Traditional Chinese Medicine in Yulin City， Shaanxi Province， Yulin 719000， China

[Abstract] Objective To study the protein expression and significance of cyclooxygenase-2 （COX-2）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and vascular endothelial growth factor C （VEGF-C） in gastric cancer. Methods The expression levels of COX-2， VEGF and VEGF-C were detected by using immunohistochemical SP method in 70 cases of gastric cancer and 30 cases of normal gastric mucosa. Results The positive expression rates of COX-2， VEGF and VEGF-C in gastric cancer were 71.4%， 62.9% and 55.7%； and were 13.3%， 6.7% and 16.7% in normal gastric mucosa. There were no statistical significant differences in positive expression rates of COX-2， VEGF and VEGF-C among patients with different age， sex， tumor site and size （P > 0.05）. There were statistical significant differences among patients with different TNM stages and lymph nodes （P < 0.05）. There were no statistical significant difference in positive expression rate of COX-2 among patients with different pathological grading （P > 0.05）； while there were statistical significant differences in VEGF and VEGF-C （P < 0.05）. There were positive correlation between the expression of COX-2 and VEGF， VEGF-C； VEGF and VEGF-C in gastric cancer （P < 0.05）. Conclusion There are over-expressions of COX-2， VEGF and VEGF-C in gastric cancer tissues. The expression of COX-2 and VEGF， VEGF-C is correlated. COX-2 may regulate the gastric cancer occurrence and progress through regulating the protein expression of VEGF and VEGF-C.

[Key words] Gastric cancer； COX-2； VEGF； VEGF-C； Immunohistochemistry

胃癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤。國際流行病學(xué)資料顯示[1]，20世紀(jì)50～90年代，全球胃癌的發(fā)生率及死亡率呈現(xiàn)平穩(wěn)降低的總態(tài)勢，但受人口老齡化、城市化及工業(yè)化等諸多因素影響，世界范圍內(nèi)每年新病例的絕對數(shù)量是增加的。然而近年來，進行我國惡性腫瘤死亡率的國際化比較發(fā)現(xiàn)，我國胃癌世界標(biāo)化死亡率男性為30.8/10萬，女性為13.8/10萬，均高于世界、發(fā)達(dá)及發(fā)展中國家的平均水平，且粗死亡率表現(xiàn)出年齡結(jié)構(gòu)性上升、年齡別死亡率推后等趨勢[2]。本實驗利用免疫組化SP染色法檢測環(huán)氧合酶-2（COX-2）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）蛋白在70例胃癌標(biāo)本和30例正常胃黏膜中的表達(dá)情況，并結(jié)合年齡、性別、腫瘤部位、病理分級、臨床分期進一步探討3種蛋白間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集陜西省榆林市中醫(yī)院（以下簡稱“我院”）病理科2013～2014年的胃鏡活檢及手術(shù)胃癌標(biāo)本70例和30例癌旁正常胃組織。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色由我院病理科醫(yī)師診斷。胃癌標(biāo)本男42例，女28例，按WHO病理分級：高-中分化40例，低分化30例；按UICC標(biāo)準(zhǔn)行TNM標(biāo)準(zhǔn)臨床分期：Ⅰ+Ⅱ級41例，Ⅲ+Ⅳ級29例。

1.2 試劑及檢測方法

濃縮型兔抗人COX-2及VEGF、VEGF-C即用型多克隆抗體和S-P試劑盒均購于北京中杉生物科技有限公司；DAB底物顯色劑購于武漢博士德生物科技有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP法，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行?？乖迯?fù)采用枸櫞酸鈉緩沖液高壓熱修復(fù)。COX-2與VEGF多克隆抗體使用1∶100稀釋，VEGF-C多克隆抗體使用1∶150稀釋。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

COX-2及VEGF、VEGF-C 3種蛋白均以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照。免疫組化結(jié)果判定如下：陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)0～10%為陰性；>10%～25%為弱陽性；>25%～75%為中等陽性；>75%為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，COX-2及VEGF、VEGF-C在胃癌及正常黏膜中的表達(dá)和胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗；COX-2與VEGF、VEGF-C之間的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白的表達(dá)情況

COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白在胃癌中陽性表達(dá)率為71.4%（50/70）、62.9%（44/70）、55.7%（39/70），而在正常胃黏膜中陽性表達(dá)率為13.3%（4/30）、6.7%（2/30）、16.7%（5/30）。經(jīng)比較，胃癌與正常胃黏膜之間COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白陽性表達(dá)率差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=23.542、26.693、12.995，P < 0.01）。胃癌組織COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白表達(dá)在年齡、性別、不同腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小分組上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期分組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），在病理分級上COX-2表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意（P > 0.05），VEGF與VEGF-C表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1（封三）、表1。

2.2 胃癌組織中COX-2及VEGF、VEGF-C蛋白表達(dá)間的相關(guān)性分析

對70例胃癌組織中COX-2及VEGF、VEGF-C三種蛋白進行Spearman等級相關(guān)分析顯示，COX-2與VEGF-C蛋白表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系（rs=0.747，P < 0.05）；COX-2與VEGF蛋白表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系（rs=0.539，P < 0.05）；VEGF與VEGF-C蛋白表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系（rs=0.082，P < 0.05）。

3 討論

胃癌的發(fā)生是一個多步驟、多因素進行性發(fā)展的過程。生理狀態(tài)下，胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡之間保持著動態(tài)平衡。這種平衡的維持有賴于癌基因、抑癌基因及一些生長因子類物質(zhì)的共同調(diào)控[3]。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素（PGs）和血栓烷的關(guān)鍵酶。COX-2為誘導(dǎo)酶，在大多數(shù)的正常細(xì)胞中是不存在COX-2的，但在一些腫瘤促進因子、炎癥細(xì)胞因子、癌基因和生長因子迅速誘導(dǎo)下形成過量PGs，致使紅腫、發(fā)熱和疼痛等現(xiàn)象的發(fā)生。另有研究報道，COX-2還參與了動脈粥樣硬化、炎癥性腸病和消化性潰瘍的炎性反應(yīng)。在胃癌漫長的發(fā)生過程中，有效發(fā)病途徑為慢性胃炎-多灶性萎縮-腸上皮化生-不典型增生-浸潤性癌[4]。研究表明，COX-2在結(jié)腸癌[5]、乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、鱗狀上皮癌變[8]等多種腫瘤組織中均高表達(dá)，其致癌機制有以下幾方面[9]：①通過PGs途徑抑制免疫細(xì)胞的活性，減少免疫蛋白的生成，從而抑制抗腫瘤免疫的發(fā)生。②COX-2上調(diào)表皮生長因子的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。③通過合成花生四烯酸，上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。④COX-2自身的過氧化物酶活性作用，與其上調(diào)MMP-2、MMP-1蛋白聯(lián)合作用，使腫瘤細(xì)胞侵襲力增強。另有研究報道，COX-2還參與了消化性潰瘍、炎癥性腸病[10]和動脈粥樣硬化[11]的炎性反應(yīng)。在本研究中，胃癌中的COX-2陽性表達(dá)率明顯高于正常胃黏膜，并在有無淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期中表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），表明COX-2與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，是胃癌轉(zhuǎn)移的重要機制之一。

胃癌的生長和轉(zhuǎn)移離不開腫瘤血管的生長，VEGF在結(jié)腸癌[12]、乳腺癌[13]、前列腺癌[14]等多種組織中高表達(dá)。研究表明，大多數(shù)癌前病變沒有大量新生血管的形成，與腫瘤組織相反，說明癌前病變進展到腫瘤，其大量新生血管形成是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵。VEGF是特異性的最強的血管內(nèi)皮刺激因子，其與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受體結(jié)合后，產(chǎn)生促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的作用，還可以增加血管的通透性，并且在血管通透性方面促進血管內(nèi)物質(zhì)滲出到血管外，為促進腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與浸潤提供了良好的條件[15]。有研究表明，血清中VEGF（S-VEGF）水平在多種癌癥患者體內(nèi)的水平較正常人高，其在一定程度上可以判斷腫瘤的預(yù)后[16]。VEGF-C是VEGF家族成員之一，不僅與只存在淋巴內(nèi)皮上受體VEGFR-3結(jié)合，促進淋巴管生成，還與受體VEGFR-2結(jié)合，抑制凋亡并增加血管通透性，并協(xié)同VEGF促進血管的生成[17]。VEGF-C與其受體VEGFR-3結(jié)合使VEGFR-3發(fā)生自磷酸化后，誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮增殖的途徑主要有三方面：①激活MAPK和Akt信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并促進腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[18]；②激活PI3K/Akt信號途徑誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮增殖并抑制凋亡[19]；③通過磷酸化Tyrl337位點的Shc和Grb2蛋白，激活PLC-γ/PKC通路促進淋巴管內(nèi)皮增殖[20]。本研究結(jié)果顯示，VEGF與VEGF-C的表達(dá)率均高于正常胃黏膜，并都在臨床病理特征中病理分級、淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。提示VEGF與VEGF-C是胃癌血管、淋巴轉(zhuǎn)移的重要原因，其水平的檢測對評估腫瘤的侵襲有意義。

COX-2、VEGF共同擁有轉(zhuǎn)錄啟動子Tcf-4結(jié)合位點，可能均受β-catenin蛋白的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2生成前列腺素E2（PGE2）致β-catenin蛋白上調(diào)，通過激活Wnt/β-catenin通路使VEGF表達(dá)升高，并且VEGF可以通過延長COX-2 mRNA的活性時間使COX-2的表達(dá)上調(diào)[21]。同時，COX-2也是VEGF-C處于轉(zhuǎn)錄水平的一個重要的上游調(diào)控基因[22]。通過COX-2催化產(chǎn)物前列腺素2（PE2）與前列腺素受體EP1結(jié)合使HER-2/Neu受體磷酸化，通過MAPK/P38通路激活NF-κB，導(dǎo)致VEGF-C基因蛋白的上調(diào)[23]。有學(xué)者研究認(rèn)為，VEGF-C通過與VEGFR-2結(jié)合，可以使VEGF表達(dá)上調(diào)，而Maspin蛋白表達(dá)下調(diào)可能與VEGF、VEGF-C蛋白的上調(diào)有關(guān)[24]。本研究結(jié)果顯示，COX-2與VEGF、VEGF-C蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，VEGF與VEGF-C蛋白表達(dá)之間也存在正相關(guān)，提示3種蛋白相互作用，協(xié)同促進胃癌的發(fā)生發(fā)展，同時檢測COX-2、VEGF、VEGF-C蛋白表達(dá)水平，在腫瘤的形成、發(fā)展及早期應(yīng)用基因靶向治療方面具有積極意義。

綜上所述，COX-2、VEGF、VEGF-C都具有促進胃癌的發(fā)生發(fā)展的作用，COX-2、VEGF、VEGF-C的復(fù)雜交互作用在惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了重要的作用。胃癌組織中COX-2的表達(dá)水平上調(diào)，影響VEGF、VEGF-C的表達(dá)，并協(xié)同胃癌發(fā)展。3個因子共同檢測可作為臨床判斷腫瘤的侵襲性及轉(zhuǎn)移潛能的參考指標(biāo)。

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（收稿日期：2015-01-30 本文編輯：程 銘）