補(bǔ)腎益智方對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠腦內(nèi)p75水平的影響

于 濤 賴世隆(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 5020)

阿爾茨海默病(AD)病人腦內(nèi)中樞膽堿能神經(jīng)元的丟失可能與神經(jīng)營養(yǎng)缺乏有關(guān)。p75是神經(jīng)生長因子(NGF)類神經(jīng)營養(yǎng)因子的低親和力受體，具有提高NGF高親和力受體TrkA的結(jié)合速度、調(diào)節(jié)Trks的酪氨酸激酶的活性及反向運(yùn)輸神經(jīng)營養(yǎng)因子等作用。另外，p75與乙酰膽堿受體(ChAT)陽性神經(jīng)元高度共存〔1，2〕。因此，檢測(cè) p75對(duì)探討補(bǔ)腎益智方對(duì)AD模型學(xué)習(xí)記憶的改善及中樞膽堿能神經(jīng)修復(fù)機(jī)制有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 Wistar大鼠(中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)72只，18～20月齡，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。Ibotenic acid(sigma公司)、補(bǔ)腎益智方(濃縮粉劑，6.44g生藥/g成藥，廣東省中醫(yī)院制劑科)、石杉?jí)A甲(片劑，上海紅旗制藥廠生產(chǎn)的雙益平片，批號(hào):990101)、抗p75抗體(Biochemica公司)(1∶30)、LSAB-mouse試劑盒(DAKO公司)。

1.2 造模 模型大鼠給予腹腔注射0.96%D-半乳糖(D-Gal，上海試劑二廠)，1次/d，連用6 w，制造老齡化大鼠模型。老年正常組腹腔注射等比例的生理鹽水。第7周參照Paxins和Watson大鼠腦立體定位圖譜中Meynert基底核定位，麻醉后在雙側(cè)無名質(zhì)區(qū)注射Ibotenic acid 1 μl(生理鹽水配制，濃度為5 μg/μl)造成AD模型。老年組在相同腦區(qū)注射等體積的生理鹽水，過程同前。術(shù)后青霉素連續(xù)治療3 d，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 分組、給藥 術(shù)后1 w，將造模存活的大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(MC);補(bǔ)腎益智方高劑量組(HD);補(bǔ)腎益智方低劑量組(LD);石杉?jí)A甲對(duì)照組(HU，相當(dāng)于0.3 mg/kg體重);老年正常組(SC)。HD(相當(dāng)于5.6 g生藥/kg體重)、LD(相當(dāng)于2.8 g生藥/kg體重)和HU三組大鼠連續(xù)灌藥4 w，1次/d。用藥劑量依據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第2版所示公式換算而出，MC和SC兩組灌以等比例的生理鹽水，時(shí)長相同。每組隨機(jī)抽取5只大鼠，灌注固定后取腦，冠狀冰凍切片，片厚40 μm。收集于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4)中備用。按試劑盒說明進(jìn)行染色處理，常規(guī)脫水，透明，樹膠封片。對(duì)照組切片不加一抗孵育，其他步驟相同。

1.4 計(jì)量學(xué)分析 p75免疫細(xì)胞化學(xué)檢查分別取三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)斷面(前囟 +1.0，+0.5和 －0.2)，含 MS、vDB 和 hDB，用 IBAS Rel 2.0圖像分析系統(tǒng)(OPTON公司)測(cè)量各個(gè)區(qū)域內(nèi)p75陽性細(xì)胞的數(shù)量、細(xì)胞平均截面積和平均灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS9.0軟件，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行齊性檢驗(yàn)，齊性后進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較選用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

各組SM-DB中單位面積內(nèi)p75陽性神經(jīng)元數(shù)量的比較見表1。各組SM-DB中單位面積內(nèi)p75陽性神經(jīng)元平均截面積的比較結(jié)果見表2。各組SM-DB中p75陽性神經(jīng)元平均灰度值的比較結(jié)果見表3。補(bǔ)腎益智方兩個(gè)組對(duì)SM-DB區(qū)域中的p75陽性細(xì)胞數(shù)目、平均截面積和平均灰度值均有十分明顯的改善作用，其中低劑量組作用最大、高劑量組次之，兩者的作用均較石杉?jí)A甲組為優(yōu);低劑量組在三個(gè)區(qū)域的陽性細(xì)胞數(shù)、hDB區(qū)的陽性細(xì)胞平均截面積以及SM區(qū)內(nèi)陽性細(xì)胞的灰度值與石杉?jí)A甲組差異均具有顯著性，且低劑量組部分測(cè)量結(jié)果與老年正常組相近，兩者之間差異無顯著性。

表1 SM-DB中單位面積內(nèi)p75陽性神經(jīng)元數(shù)量(±s，n=5)

表1 SM-DB中單位面積內(nèi)p75陽性神經(jīng)元數(shù)量(±s，n=5)

與SC組比:1)P＜0.05，2)P＜0.01，3)P＜0.001;與 MC組比較:4)P＜0.05，5)P＜0.001;與HU組比較:6)P＜0.01

組別SM vDB hDB SC 20.40±6.80 25.20±3.35 27.00±3.67 HU 13.60±1.671) 14.80±5.312) 16.00±4.472)LD 22.00±6.525)6) 24.00±5.342)5) 25.40±5.812)5)HD 15.80±5.404) 18.20±3.831)4) 20.80±4.441)4)MC 8.60±1.672) 11.20±3.773) 13.00±3.163)

表2 各組SM-DB中單位面積內(nèi)P75陽性神經(jīng)元平均截面積比較(±s，n=5)

表2 各組SM-DB中單位面積內(nèi)P75陽性神經(jīng)元平均截面積比較(±s，n=5)

組別SM vDB hDB SC 74.00±18.59 80.19±20.07 94.21±7.94 HU 55.60±18.56 58.07±10.19 61.55±6.083)LD 77.62±11.455) 78.34±18.465) 90.42±14.272)6)HD 59.44±11.504) 63.53±13.63 73.50±6.312)5)6)MC 33.94±9.882) 46.48±15.092) 53.59±5.683)

表3 SM-DB中p75神經(jīng)元平均灰度值的比較(±s，n=5)

表3 SM-DB中p75神經(jīng)元平均灰度值的比較(±s，n=5)

組別SM vDB hDB SC 52.85±18.49 74.25±19.20 91.07±42.34 HU 35.48±8.21 42.26±12.301) 57.20±16.57 LD 63.73±16.211)5)6) 66.99±19.80 94.26±43.454)HD 40.45±10.644) 47.06±13.86 56.23±28.36 MC 20.16±7.282) 39.44±13.281) 38.29±18.201)

3 討論

p75NTFR(簡稱為p75)與所有的神經(jīng)元纏結(jié)(NTs)都有相似的親和力，也是NGF低親和力受體。p75主要分布于海馬、BF、新紋狀體、下丘外側(cè)核、豆?fàn)詈?、小腦蒲肯野細(xì)胞、腦干和脊髓，其中在基底前腦內(nèi)p75含量較豐富。有研究證明p75與ChAT陽性神經(jīng)元有65%～90%共存〔3〕，提示p75與膽堿能神經(jīng)元之間有著密切的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎益智方可以明顯提高該模型腦內(nèi)的p75水平，其作用優(yōu)于石杉?jí)A甲，且作用大小與用藥劑量有較明顯的關(guān)系。提示補(bǔ)腎益智方可能具有類似p75促進(jìn)劑的作用;同時(shí)，還提示p75水平的恢復(fù)可能與該模型膽堿能系統(tǒng)的改善有著某種必然的聯(lián)系。

1 Schatteman GC，Gibbs L，Lanahan AA，et al.Expression of NGF receptor in the developing and adult primate central nervous system〔J〕.J Neurosci，1988;8(3):860-73.

2 Steininger TL，Wainer BH，Klein R，et al.High-affinity nerve growth factor receptor(Trk)immunoreactivity is localized in cholinergic neurons of the basal forebrain and striatum in the adult rat brain〔J〕.Brain Res，1993;612(1-2):330-5.

3 Kordower JH，Bartus RT，Bothwell M，et al.Nerve growth factor receptor immunoreactivity in the nonhuman primate(Cebus apella):distribution，morphology，and colocalization with cholinergic enzymes〔J〕.J Comp Neurol， 1988;277(4):465-86.