易腦卒中型腎血管型高血壓大鼠血漿中一氧化氮、腫瘤壞死因子-α及C反應(yīng)蛋白含量在高血壓進(jìn)程中的動(dòng)態(tài)變化

何國英 張美云 (天津市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300120)

臨床研究發(fā)現(xiàn)，高血壓是腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，該類患者腦出血率、死亡率顯著高于其他類型腦卒中患者〔1〕。但高血壓誘發(fā)腦卒中的發(fā)病機(jī)制臨床尚無確切結(jié)論，分析可能與超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、一氧化氮(NO)及腫瘤壞死因子(TNF)-α等多種細(xì)胞因子共同作用有關(guān)〔2〕。為分析 hs-CRP、NO、TNF-α在高血壓型腦卒中的表達(dá)情況及臨床價(jià)值，本文選用健康雄性SD大鼠進(jìn)行雙腎雙夾法造腎血管型高血壓大鼠(RHRSP)模型研究。雙腎雙夾法造RHRSP模型是一種血壓上升穩(wěn)定，存在血管閉塞、纖維素樣壞死、微動(dòng)脈瘤生成等多種病理改變的造模方法，與高血壓型腦卒中具有極高相似度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及試劑與藥品 健康雄性SD大鼠36只進(jìn)行1～36數(shù)字編號(hào)，體重80～120 g，平均(98.4±9.2)g;由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證編號(hào):HA20140018，喂養(yǎng)于室溫25℃，自由進(jìn)食進(jìn)水的環(huán)境中。再隨機(jī)分為研究組和對(duì)照組各18只，研究組采用雙腎雙夾法造RHRSP模型，對(duì)照組采用假手術(shù)方法(不上銀夾)。選用深圳晶美生物工程有限公司生產(chǎn)的大鼠血清TNF-α ELISA試劑盒;選用上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的蘇木精;選用武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的多聚賴氨酸;選用南京建成生物工程研究所提供的NO試劑盒。選用中山大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所提供的0.4 mm環(huán)形銀夾;選用中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院提供的鼠尾測壓儀;選用美國Bio-Tek ELX808型酶標(biāo)儀;選用上海第三分析儀器廠生產(chǎn)的721可見光分光光度計(jì)。

1.2 雙腎雙夾RHRSP模型制作 選用水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹部正中切口，分離雙側(cè)腎動(dòng)脈，于腎動(dòng)脈起始位置鉗夾0.4 mm內(nèi)徑銀夾，觀察腎臟有無血瘀、壞死及蒼白情況，如無則逐步縫合腹膜、肌肉、皮膚，術(shù)后常規(guī)抗感染治療。于術(shù)后6 h恢復(fù)喂食。對(duì)照組采用假手術(shù)方法，操作同上但不上銀夾。

1.3 收縮壓(SBP)、舌下靜脈血NO、CRP及TNF-α的測定方法 術(shù)前于37℃恒溫下預(yù)熱鼠尾測壓儀后檢測大鼠尾動(dòng)脈SBP，檢測 3 次，取平均值，術(shù)后第 1、2、4、8、12、16 周再行尾動(dòng)脈SBP檢測操作。術(shù)后血壓≥150 mmHg判定為高血壓大鼠。于術(shù)前、術(shù)后第 1、2、4、8、12、16 周各取大鼠舌下靜脈血 1ml，離心，存儲(chǔ)于－80℃待用。最后一次取血后處死大鼠，常規(guī)腦灌注取腦，腦組織行HE染色，以觀察腦動(dòng)脈硬化情況。用硝酸還原酶法檢測大鼠血清NO值。選用雙抗體夾心ELISA法檢測血清CRP、TNF-α值，于酶標(biāo)儀450nm處檢測OD值，結(jié)果導(dǎo)入curve expert1.3軟件處理。計(jì)算最終CRP、TNF-α含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組SBP變化情況 術(shù)前兩組SBP測定值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，術(shù)后第 1、2、4、8、12、16 周研究組 SBP 值顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，且呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，與術(shù)前比較顯著增高(P＜0.05)。見表1。

2.2 兩組hs-CRP變化情況 術(shù)前兩組CRP測定值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，術(shù)后第 1、2、4、8、12、16 周研究組 hs-CRP值顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，且呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，與術(shù)前比較顯著增高(P＜0.05)。見表2。

2.3 兩組NO變化情況 術(shù)前兩組NO測定值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，術(shù)后第 1、2、4、8、12、16 周兩組 NO 值差異顯著(P ＜0.05)，研究組呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，在術(shù)后第2周達(dá)到最高值后逐漸下降，與術(shù)前比較差異顯著(P＜0.05)。見表3。

2.4 兩組TNF-α變化情況 術(shù)前兩組TNF-α測定值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，術(shù)后第 1、2、4、8、12、16 周研究組 TNF-α值顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，且呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，與術(shù)前比較顯著增高(P＜0.05)。見表4。

表1 兩組SBP變化情況(±s，mmHg)

表1 兩組SBP變化情況(±s，mmHg)

與術(shù)前比較:1)P＜0.05，下表同

組別 n 術(shù)前 第1周 第2周 第4周 第8周 第12周 第16周對(duì)照組 17 103.6±8.2 105.6±7.9 106.2±8.1 108.3±7.6 107.2±8.5 108.6±8.4 108.9±11.3研究組 16 101.9±7.1 134.3±9.51) 151.3±11.21) 172.5±12.61) 193.4±16.81) 215.8±21.71) 249.7±33.61)t/P值 0.635/0.453 9.459/＜0.001 13.315/＜0.001 17.849/＜0.001 18.769/＜0.001 18.932/＜0.001 16.338/＜0.001

表2 兩組hs-CRP變化情況(±s，mg/L)

表2 兩組hs-CRP變化情況(±s，mg/L)

組別 n 術(shù)前 第1周 第2周 第4周 第8周 第12周 第16周對(duì)照組 17 0.29±0.09 0.31±0.08 0.30±0.07 0.32±0.09 0.32±0.08 0.33±0.10 0.32±0.09研究組 16 0.28±0.09 0.38±0.101) 0.44±0.121) 0.62±0.171) 0.83±0.251) 0.97±0.291) 1.08±0.311)t/P值 0.319/0.724 2.227/0.028 4.124/＜0.001 6.391/＜0.001 7.994/＜0.001 8.936/＜0.001 10.258/＜0.001

表3 兩組NO變化情況(±s，μmol/L)

表3 兩組NO變化情況(±s，μmol/L)

組別 n 術(shù)前 第1周 第2周 第4周 第8周 第12周 第16周對(duì)照組 17 33.1±4.5 33.6±4.7 33.7±4.3 32.4±3.8 34.1±3.9 30.7±4.2 31.9±4.7研究組 16 32.9±4.1 36.8±3.71) 52.5±5.21) 29.3±3.21) 26.3±3.71) 22.6±3.11) 21.6±3.11)t/P值 0.133/0.926 2.164/0.031 11.347/＜0.001 2.527/0.018 5.886/＜0.001 7.145/＜0.001 8.362/＜0.001

表4 兩組TNF-α變化情況(±s，pg/ml)

表4 兩組TNF-α變化情況(±s，pg/ml)

組別 n 術(shù)前 第1周 第2周 第4周 第8周 第12周 第16周對(duì)照組 17 425.6±118.7 430.6±120.4 431.7±115.6 433.5±127.6 437.5±119.8 438.4±122.7 441.3±142.3研究組 16 421.2±121.5 490.3±176.21) 583.2±213.51) 783.4±253.71) 871.3±273.91) 713.5±283.41)1 089.3±326.51)t/P值 0.105/0.934 1.143/0.206 2.572/0.015 5.069/＜0.001 7.146/＜0.001 9.128/＜0.001 10.862/＜0.001

3 討論

高表達(dá)的血管緊張素(Ang)不但可直接作用于血管收縮，還可增強(qiáng)交感神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)皮素以及醛固酮等物質(zhì)的釋放，最終參與高血壓的發(fā)生、發(fā)展〔3〕。NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的一種生理性血壓調(diào)節(jié)劑，該物質(zhì)可與血管平滑肌細(xì)胞的鳥苷酸環(huán)化酶相互作用，并導(dǎo)致cCMP高表達(dá)，最終抑制血管擴(kuò)張，降低平滑肌細(xì)胞分裂、增殖〔4〕。此外，NO還可抑制Ang-Ⅱ的合成，抑制腎血管性血壓的升高。研究顯示，口服NO前體L-精氨酸可提供RHRSP的NO合成量，大鼠腎排鈉、排水能力也隨之增強(qiáng)，血壓可顯著控制〔5〕。本研究提示NO合成、釋放與高血壓發(fā)生、發(fā)展存在重要聯(lián)系。在血壓正常的情況，血管張力及動(dòng)脈血壓可被內(nèi)皮型NO合酶(eNOS)調(diào)節(jié)，但在高血壓狀態(tài)下，eNOS生成的NO無法滿足血管張力需求，這導(dǎo)致誘導(dǎo)性NOS(iNOS)激活，并合成大量的NO，以滿足調(diào)節(jié)血壓的需求，這可能是研究組大鼠術(shù)后第2周達(dá)到最高值后逐漸下降的原因。

炎癥及相關(guān)因子與高血壓、心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展存在重要聯(lián)系。TNF-α是人體重要的一種炎癥因子，是炎癥反應(yīng)的核心因子之一，具有誘導(dǎo)黏附分子表達(dá)、刺激細(xì)胞生長等多種功能〔6〕。當(dāng)生物體血壓增高時(shí)，血管內(nèi)異常的血流動(dòng)力學(xué)將導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞出現(xiàn)缺氧狀態(tài)，進(jìn)而刺激TNF-α的合成，導(dǎo)致高血壓癥狀進(jìn)一步惡化。高表達(dá)的TNF-α可導(dǎo)致血管收縮、擴(kuò)張不平衡，同時(shí)還可加劇單核細(xì)胞的聚集，導(dǎo)致炎性系統(tǒng)激活，并加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展〔7〕。本研究表明TNF-α是高血壓及腦卒中病理改變的重要參與因子。

hs-CRP可直接參與局部或全身性炎癥反應(yīng)，誘使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增高血管阻力〔8〕。hs-CRP還可抑制NO及前列腺素的表達(dá)，導(dǎo)致這些物質(zhì)的血管舒張、抗血栓能力消失，最終加速心血管疾病發(fā)展。此外，hs-CRP介導(dǎo)的全身性炎癥反應(yīng)還可增強(qiáng)白細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，患者機(jī)體內(nèi)超氧陰離子釋放量增多，加速NO的消耗〔9〕。高表達(dá)的hs-CRP還可加速血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，加速動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣硬化發(fā)展，最終參與高血壓及腦卒中等疾病的發(fā)展〔10〕。

綜上，RHRSP模型大鼠存在明顯血管壁內(nèi)皮功能異常及炎癥反應(yīng)，CRP、TNF-α、SBP升高及NO降低是這一病理改變的重要影響因素，并共同作用于高血壓性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展，提示臨床可通過檢測CRP、TNF-α、NO來實(shí)現(xiàn)高血壓性腦卒中患者的早期診斷和防治干預(yù)。

1 張志敏，趙連友，盧 凡，等.高同型半胱氨酸對(duì)高血壓大鼠心肌細(xì)胞GRP78和CHOP表達(dá)及左室肥厚的影響〔J〕.中國循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2014;1(2):223-6，228.

2 全毅紅，秦 潔.疏血通注射液聯(lián)合卡托普利對(duì)老年高血壓患者血壓晝夜節(jié)律及血漿內(nèi)皮素和一氧化氮的影響〔J〕.中國動(dòng)脈硬化雜志，2011;19(4):347-50.

3 萬 鑫，代成波，曹裕民，等.誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因多態(tài)性與顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性研究〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2013;15(4):382-5.

4 王云玲，張丹紅，肖林琴，等.血栓素A2受體基因多態(tài)性在腦梗死發(fā)病中的作用〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2013;12(11):1081-6.

5 Sumbria RK，Boado RJ，Pardridge WM.Brain protection from stroke with intravenous TNF-α decoy receptor-Trojan horse fusion protein〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2012;32(10):1933-8.

6 陳麗娜，徐清斌，馬 萍.內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因G894T多態(tài)性與寧夏漢族原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究〔J〕.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011;33(10):909-12.

7 祁玉鳳，李常新，吳曉巍，等.人工寒潮對(duì)易卒中型腎血管性高血壓大鼠凝血和纖溶系統(tǒng)的變化研究〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2011;9(4):459-62.

8 Zwolinska-Wcislo M，Brzozowski T，Ptak-Belowska A.Nitric oxide-releasing aspirin but not conventional aspirin improves healing of experimental colitis〔J〕.World J Gastroenterol，2011;17(36):4076-89.

9 李 偉，王 淼，張海峰，等.血漿β2-微球蛋白對(duì)高血壓患者動(dòng)脈粥樣硬化的評(píng)價(jià)探討〔J〕.河北醫(yī)學(xué)，2014;1(4):597-9.

10 劉淑云，張 平，林仁勇，等.TNF-α預(yù)測高血壓大鼠發(fā)生腦卒中的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.安徽醫(yī)藥，2014;18(3):464-7.