活性維生素D3對進展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)損傷的干預作用

何 珊 黃勁松 沈 燕 何平紅 楊 霞 達靜靜 易 韋 查 艷

(貴州省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州 貴陽 550002)

腎小管-間質(zhì)損傷是導致腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要過程，其病變程度與腎功能損害程度呈正相關(guān)。阻止或減慢腎小管間質(zhì)纖維化的進展，可以預防慢性腎衰竭的發(fā)生〔1，2〕。維生素D，尤其是活性代謝產(chǎn)物1，25-二羥維生素 D3〔1，25-(OH)2-VitD3〕或骨化三醇在調(diào)節(jié)各種生物過程如鈣穩(wěn)態(tài)、免疫調(diào)節(jié)、細胞增殖和分化中發(fā)揮至關(guān)重要的作用〔3〕。但是，骨化三醇對進展性腎炎腎小管間質(zhì)損傷的保護作用尚不完全清楚。本研究旨探討活性維生素D3對進展性腎炎大鼠模型中腎間質(zhì)纖維化基因結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達的影響，并觀察腎臟組織病理形態(tài)學改變，深入了解活性維生素D3對進展性腎炎大鼠腎間質(zhì)纖維化的可能作用途徑及影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料 活性維生素D3購自美國Sigma公司，IgG(OX-7)鼠抗人Thy1.1單克隆抗體購于美國Neo Markers公司，兔抗鼠低氧誘導因子(HIF)1-α多克隆購于加拿大 Assay Designs Stressgen公司，大鼠CTGF mRNA原位雜交試劑盒購于武漢BOSTER生物工程有限公司。

1.2 儀器 全自動多功能生化分析儀(日本Hitachi公司);光學顯微鏡(日本Olympus公司);顯微圖像分析系統(tǒng)(Olympus C3040-ADU)。

1.3 動物模型制備及分組 雄性SD大鼠(重慶騰鑫生物技術(shù)公司提供，二級)21只，體重(131.2±10)g。按數(shù)字隨機表法分為假手術(shù)組(對照組，只做腎包膜剝離，不予腎臟切除)、進展性腎炎組(模型組)、活性維生素D3干預組(治療組)，每組7只。進展性腎炎模型制備參照文獻〔4〕，行右腎摘除術(shù)，分別于術(shù)后第1、2周予尾靜脈注射IgG(OX-7)鼠抗人Thy1.1單克隆抗體1.2 mg/kg，共2次。活性維生素D3干預組于術(shù)后予活性維生素D3 6 ng·100 g－1·d－1加入飲水中灌胃至8 w。所有大鼠均于8 w后處死，收集24 h尿液，取大鼠心臟血并制作腎組織標本。

1.4 觀察指標與檢測方法

1.4.1 24 h尿蛋白定量 處死大鼠前3 d，將大鼠放入代謝籠中收集24 h尿液，每只收集3次，用雙縮脲法測定尿蛋白含量。

1.4.2 血生化檢測 取大鼠心臟血，測定血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、鈣(Ca)、磷(P)等水平。

1.4.3 腎臟組織病理學檢查 腎組織以10%甲醛固定并編號，石蠟包被，2 μm厚連續(xù)切片，過碘酸-雪夫(PAS)染色，光鏡下觀察腎臟病理改變。

1.4.4 免疫熒光法檢測HIF1-α的表達 將大鼠腎臟新鮮組織塊包埋，液氮中速凍，在恒冷切片機上切成5 μm厚的組織切片。4℃冰丙酮固定30 min，4%小牛血清 37℃溫箱封閉30 min，加入兔抗鼠 HIF1-α 多克隆一抗(1∶100)，37℃溫箱孵育1 h后，4℃冰箱過夜。次日將切片用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，加入FITC標記的羊抗兔IgG抗體(1∶400，避光)，37℃溫箱孵育1 h，PBS浸洗5 min×3次，緩沖甘油封片。使用激光共聚焦顯微鏡(Olympus IX71)掃描488 nm波長的熒光。將數(shù)字化圖像儲存于計算機，待實驗結(jié)束后進行圖像分析。

1.4.5 原位雜交法檢測CTGF mRNA的表達 取2 μm厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性酶，熱修復抗原，抗原抗體反應，DAB顯色、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。CTGF mRNA原位雜交所用探針為地高辛標記的針對CTGF基因的多相寡核苷酸探針，按試劑盒說明書進行。陽性產(chǎn)物呈深紫色，不加探針為陰性對照。每張切片隨機選取10個高倍視野，每個視野代表0.13 mm2的區(qū)域面積，計數(shù)CTGF陽性細胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件進行t檢驗及方差分析。

2 結(jié)果

2.1 活性維生素D3對進展性腎炎大鼠24 h尿蛋白、腎功能的影響 術(shù)后8 w，模型組24 h尿蛋白量、Scr和BUN均顯著高于對照組(均P＜0.05)。經(jīng)活性維生素D3干預治療后，與模型組比較，24 h尿蛋白量和BUN均顯著降低(均P＜0.05)，Scr差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Ca、P水平在活性維生素D3治療前后無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 活性維生素D3對腎組織病理變化的影響 PAS染色顯示假手術(shù)組腎小管間質(zhì)形態(tài)基本正常。模型組腎小管上皮細胞萎縮、脫落，腎小管管腔擴張、間質(zhì)水腫，管型堵塞。與假手術(shù)組比較，模型組間質(zhì)炎癥和纖維化進行性加重。與模型組比較，治療組腎小管間質(zhì)損傷得到改善。見圖1。

表1 各項檢測指標在各組大鼠中的比較(±s，n=7)

表1 各項檢測指標在各組大鼠中的比較(±s，n=7)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

指標 對照組 模型組 治療組尿蛋白(mg/24 h) 18.85±3.23 289.18±25.381)131.37±8.652)1.68±0.08 1.59±0.05 1.61±0.07 Scr(μmol/L) 47.45±3.12 165.27±13.351)129.59±7.87 BUN(mmol/L) 8.92±2.73 16.28±4.331)13.02±3.872)Ca(mmol/L) 1.97±0.04 1.89±0.03 1.92±0.06 P(mmol/L)

2.3 活性維生素D3對慢性腎衰竭大鼠腎小管間質(zhì)HIF-1α表達的影響 HIF-1α主要集中表達于腎小管上皮細胞的胞質(zhì)，模型組腎小管上皮細胞中HIF-1α表達(2.022±0.254)較對照組(0.268±0.101)顯著增多(P＜0.01);應用活性維生素D3治療后，HIF-1α表達(0.746±0.217)均較模型組明顯減少(P＜0.05)，見圖2。

2.4 活性維生素D3對進展性腎炎大鼠腎間質(zhì)CTGF mRNA表達的影響 CTGF mRNA表達主要集中于腎小管上皮細胞和間質(zhì)細胞的胞質(zhì)，模型組腎間質(zhì)CTGF mRNA表達(40.5±13.8)較對照組(20.1±4.0)顯著增多(P＜0.01);應用活性維生素D3治療后，CTGF mRNA表達(61.8±10.2)均較模型組明顯減少(P＜0.05)。見圖3。

圖1 各組大鼠腎間質(zhì)的組織病理學改變(PAS，×200)

圖2 各組大鼠腎間質(zhì)HIF-1α的變化(免疫熒光，×200)

圖3 各組大鼠腎間質(zhì)CTGF mRNA的變化(原位雜交，×200)

3 討論

大鼠系膜細胞表達胸腺細胞的抗-Thy-1.1蛋白。給予抗-Thy-1.1抗體后可誘導系膜增生性進展性腎炎的形成。該模型的早期病理改變表現(xiàn)為系膜組織的損傷及在抗體注射后的幾小時內(nèi)出現(xiàn)多形核中性粒細胞和單核細胞在腎小球的聚集〔5〕。近年來發(fā)現(xiàn)，進展性腎炎大鼠腎臟組織中存在小管間質(zhì)持續(xù)性的炎癥和缺血、缺氧，腎小管-間質(zhì)細胞的慢性低氧可能在腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用〔6〕。本課題組前期研究顯示模型組HIF-1α明顯高于假手術(shù)組，證實在發(fā)生小管間質(zhì)纖維化前腎小管存在明顯慢性缺氧，處于氧化應激狀態(tài)〔7〕。

活性維生素D的代謝產(chǎn)物1，25-(OH)2-VitD3通過減輕系膜增生性進展性腎炎及殘腎模型中腎小球硬化的損傷而發(fā)揮了抗腎臟纖維化的作用〔8〕。系膜增生性腎炎模型大鼠是目前觀察進展性腎炎比較理想的動物模型〔9〕，本研究說明進展性腎炎大鼠模型造模成功。本研究依據(jù)文獻資料確定了活性維生素D3的劑量〔10〕，并且該劑量的活性維生素 D3沒有引起血Ca、P的變化，排除了維生素D3對Ca、P代謝的影響。予以活性維生素D3干預治療后發(fā)現(xiàn)，活性維生素D3可以通過減少蛋白尿抑制腎臟纖維化，提高腎臟功能。

CTGF可特異刺激間充質(zhì)來源細胞如成纖維細胞增生，并使細胞分泌細胞外基質(zhì)如膠原蛋白(Col)Ⅲ、纖連蛋白和α5整合素顯著增加。在各種腎臟疾病病人的腎活檢組織中，有明顯腎間質(zhì)纖維化病變的局部組織內(nèi)CTGF表達增加。由于CTGF生物學效應較單一，因此阻斷CTGF表達或抑制其活性，可能是一種預防纖維化的有效手段。本研究進一步證實了活性維生素D3可能是通過減少HIF-1α的表達，從而使CTGF表達減少，減輕腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

1 Siragy HM，Carey RM.Role of the intrarenal renin-angiotensin-aldosterone system in chronic kidney disease〔J〕.Am J Nephrol，2010;31(6):541-50.

2 Yan Z，Juan K，Dilip KD，et al.Vitamin D receptor attenuates renal fibrosis suppressing the renin-angiotensin system〔J〕.J Am Soc Nephrol，2010;21(6):966-73.

3 levin A，Bakris GL，Molitch M，et al.Prevalence of abnormal serum vitamin D，PTH，calcium and phosphorus in patients with chronic kidney disease:Results of the Study to Evaluate Early Kidney Disease(SEEK)〔J〕.Kidney Int，2007;71(1):31-8.

4 査 艷，余芳芳，沈 燕，等.血管緊張素受體拮抗劑在進展性腎炎大鼠模型中對慢性低氧引起腎小管間質(zhì)損害的抑制作用〔J〕.中國當代醫(yī)藥，2011;18(22):15-8.

5 Takiyama Y，Harumi T，Watanabe J，et al.Tuhular iniury in a rat model of type 2 diabetes is prevented by mefformin:a possible role of HIF-lα expression and oxygen metabolism〔J〕.Diabetes，2011;60(3):981-92.

6 査 艷，胡 英，黃斗全，等.慢性低氧對進展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)的損害〔J〕.中國當代醫(yī)藥，2011;18(20):14-6.

7 Panichi V，Migliori M，Taccola D，et al.Effects of 1，25(OH)2D3 in experimental mesangial proliferative nephritis in rats〔J〕.Kidney Int，2001;60(1):87-95.

8 Li Y，Spataro BC，Yang J，et al.1，25-dihydroxyvitamin D 3 inhibits renal interstitial myofibroblast activation by inducing hepatocyte growth factor expression〔J〕.Kidney Int，2005;68(4):1500-10.

9 Manotham K，Tanaka T，Matsumoto M，et al.Evidence of tubular hypoxia in the early phase in the remant kidney model〔J〕.J Am Soc Nephrol，2004;15(5):1277-88.

10 李紅芬，林 珊，賈俊亞，等.長期低劑量1，25-二羥基維生素D3對尿毒癥大鼠腎臟水通道蛋白2表達的影響〔J〕.中華腎臟病雜志，2013;29(2):124-8.