長鏈非編碼RNA-PVT1在人胃癌組織中的表達及臨床意義

丁 健 李 丹 龔敏貞 王錦坡 吳 婷 王承黨

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，福建 福州 350005)

諸多胃癌患者就診時已經(jīng)處于腫瘤晚期，失去了手術(shù)和化療機會〔1〕。尋找新的腫瘤標記物對胃癌進行早期診斷和分期是臨床迫切需要解決的問題和難題。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)的發(fā)現(xiàn)為這個問題的解決提供了新思路和研究方向。目前多數(shù)研究者認為，lncRNAs可能在基因表達過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如在神經(jīng)膜細胞瘤細胞株中抑制lncRNA的表達可以有效地抑制細胞增殖〔2，3〕。本研究嘗試使用lncRNA芯片和qPCR技術(shù)尋找胃癌新的腫瘤標記物，并判斷此標記物與胃癌臨床特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 Trizol試劑和雙鏈cDNA合成試劑盒購自美國Life Technologies公司。PrimeScript?1ststrand cDNA合成試劑盒，日本TaKaRa生物公司。人 lncRNA 4×180 k表達芯片(包含37 000人lncRNAs和34 000 mRNA探針)和雙鏈cDNA標記試劑盒購自北京博奧生物技術(shù)公司。LightCycler Brilliant SYBR Green qRT-PCR試劑盒，美國invitrogen公司。Agilent G2565CA芯片掃描儀，美國Agilent公司。引物由上海生工生物公司合成。其他試劑為進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 lncRNAs表達芯片篩選胃癌組織lncRNAs表達 2例胃癌標本和癌旁組織取自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院術(shù)中標本。手術(shù)標本于手術(shù)切除后迅速放入液氮，并存于－80℃冰箱備用。取100 mg胃癌組織和癌旁組織，加1 ml的Trizol RNA抽提試劑，按照試劑說明抽提總RNA。將樣品測定RNA在分光光度計260 nm、280 nm及230 nm的吸收值，以計算濃度并評估純度。使用雙鏈cDNA合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，合成雙鏈互補cDNA;使用博奧公司DNA標記試劑盒進行雙鏈互補DNA的標記，使用分光光度計檢測熒光標記效率，以保證后續(xù)芯片實驗結(jié)果的可靠性，將雙鏈cDNA與人lncRNA芯片進行雜交。雜交后清洗，使用Agilent G2565CA芯片掃描儀進行掃描。掃描數(shù)據(jù)使用Genespring GX11軟件進行處理(Agilent公司產(chǎn)品)。不同表達基因使用隨機變量模型進行處理。對數(shù)據(jù)進行分層聚類分析。

1.2.2 實時定量PCR檢測人胃癌標本PVT1的表達 31例胃癌標本和癌旁組織取自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2012年10月至2013年11月胃癌手術(shù)標本。取100 mg胃癌組織和癌旁組織，加1 ml的Trizol RNA抽提試劑，按照試劑說明抽提總RNA。檢測樣品RNA在分光光度計260 nm、280 nm及230 nm的吸收值，以計算濃度并評估純度。抽取1.0 μg總RNA合成cDNA，使用PrimeScript?1ststrand cDNA合成試劑盒進行操作。使用LightCycler Brilliant SYBR Green qRT-PCR試劑盒對PVT1進行定量表達，操作按照說明書進行。引物自行設(shè)計并合成，序列:5’ttggcacatacagccatcat和 3’gcagtaaaaggggaacacca，總qPCR產(chǎn)物長度為102 bp。使用人β-actin基因表達對每例樣本PVT1表達進行標準化定量。β-actin基因引物:5’agcgagcatcccccaaagtt和 3’gggcacgaaggctcatcatt，產(chǎn)物全長 285 bp。上述qPCR反應(yīng)使用溶解曲線分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用秩和分析及四格表χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 lncRNAs表達芯片篩選胃癌組織中高表達lncRNAs 部分lncRNAs在胃癌組織中高表達，其中PVT1在2例胃癌組織中表達量分別是癌旁組織的5.128和5.755倍，見圖1，表1。

2.2 qPCR檢測胃癌組織和癌旁組織PVT1表達的差異 胃癌組織中PVT1表達明顯高于癌旁組織P=0.041 4，見圖2。

2.3 PVT1表達和胃癌患者臨床特征的關(guān)系 按照PVT1在成對胃癌和癌旁組織中表達的高低分為PVT1高表達組(胃癌PVT1表達/癌旁PVT1表達＞2)和PVT1低表達組(胃癌PVT1表達/癌旁PVT1表達＜0.5)。PVT1高表達與患者的年齡、性別、局部浸潤、遠處轉(zhuǎn)移和臨床分型都沒有相關(guān)性(P＞0.05)，與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P=0.022 0)，見表2。

表1 胃癌組織中高表達的lncRNAs，共36個(合并不同探針對同一分子的檢測)

圖1 lncRNAs表達芯片對胃癌和癌旁組織中l(wèi)ncRNAs表達的檢測結(jié)果

圖2 31例胃癌組織中PVT1表達差異比較

表2 PVT1表達和胃癌患者臨床特征的關(guān)系(n)

3 討論

PVT1是原癌lncRNAs之一。PVT1基因的長度大于300 kb，位于MYC下游57 kb處，兩者共同定位于人類染色體8q24〔4，5〕。盡管PVT1不能產(chǎn)生任何蛋白質(zhì)產(chǎn)物，但由于其特殊的定位仍然引起了研究者的注意。PVT1和MYC基因異位與Burkitt淋巴瘤密切相關(guān)〔6〕。有研究者證明在逆轉(zhuǎn)錄病毒所致的小鼠T細胞淋巴瘤中，PVT1產(chǎn)生的microRNA產(chǎn)物——mmumiR-1204表達明顯升高，mmu-miR-1204進而可以導(dǎo)致P53基因水平升高，并引起P53依賴的細胞死亡，可能是機體的一種保護機制〔7〕。如果乳腺癌和結(jié)腸癌等患者MYC和PVT1同時出現(xiàn)高表達，往往預(yù)示著病情發(fā)展快，病人預(yù)后差〔8，9〕。故而研究者認為PVT1的地位可能和MYC類似，兩者發(fā)揮協(xié)調(diào)作用。

本項研究結(jié)果顯示PVT1在2例胃癌組織中均有高表達，qPCR結(jié)果顯示，在胃癌組織中PVT1表達較癌旁組織明顯升高，提示PVT1高表達可以作為胃癌新的特異性標志物。進一步顯示PVT1高表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)性，提示PVT1高表達可以作為胃癌患者伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特異性標志物。臨床工作中，如果胃癌患者標本檢測到高表達PVT1應(yīng)警惕有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的可能性。

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