老年晚期結(jié)直腸癌患者腫瘤組織胸苷酸合成酶表達(dá)與氟尿嘧啶敏感性、副反應(yīng)及預(yù)后的關(guān)系

馮 莉 王貴英 (河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 石家莊 0500)

結(jié)直腸癌好發(fā)于中老年人群，近年發(fā)病率及病死率呈上升趨勢(shì)〔1〕。以手術(shù)為主，化療、放療為輔的綜合治療方案是目前結(jié)直腸癌有效的治療方法，而氟尿嘧啶(5-Fu)為結(jié)直腸癌患者化療重要藥物，因此患者對(duì)于5-Fu敏感性可影響其預(yù)后〔2〕?；熢跉缯０┘?xì)胞的同時(shí)會(huì)損傷正常細(xì)胞組織，導(dǎo)致患者出現(xiàn)各種副反應(yīng)。老年結(jié)直腸癌患者由于機(jī)體功能衰退，對(duì)化療耐受性較差，從而影響其治療效果。因此化療前正常評(píng)估患者對(duì)化療方案的敏感性及對(duì)毒副反應(yīng)的耐受性將有助于促進(jìn)患者預(yù)后。胸苷酸合成酶(TS)是增殖期細(xì)胞所必需蛋白質(zhì)，是DNA合成反應(yīng)中的重要酶類(lèi)〔3〕。近年研究指出〔4〕，TS表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及化療敏感性有密切關(guān)系。本研究探討老年結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中TS陽(yáng)性表達(dá)情況及其與5-Fu敏感性、副反應(yīng)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料及方法

1.1 一般資料 2012年6月至2014年6月78例確診為結(jié)直腸癌老年患者，納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理組織學(xué)確診為結(jié)直腸癌;②參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)分期(第7版)為Ⅲ～Ⅳ期;③卡氏(KPS)評(píng)分≥70分;④術(shù)前經(jīng)腹部CT或B超檢查排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;⑤術(shù)后均應(yīng)用5-Fu為主的化療方案。排除標(biāo)準(zhǔn):合并惡性腫瘤史或臨床資料不全患者。其中男45例，女33例;年齡62～75歲，平均(66.3±3.8)歲。病理類(lèi)型:高分化 24例，中分化24例，低分化30例。臨床分期:Ⅲ期38例，Ⅳ期40例。浸潤(rùn)程度:T1 19例，T2 12例，T3 30例，T4 17例。

1.2 免疫組化法

1.2.1 主要試劑 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);TS單克隆抗體(即用型，購(gòu)于北京中衫金橋公司);辣根過(guò)氧化物酶(上海朗瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司)。

1.2.2 步驟 調(diào)取本院病理科中保存完整的標(biāo)本蠟塊，重新切片采用SP法進(jìn)行免疫組化染色。具體操作如下:將標(biāo)本蠟塊切成4 μm厚切片，于室溫下采用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。應(yīng)用3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，以0.01 mol/L PBS沖洗2次。采用正常羊血清工作液封閉樣本10 min，加入鼠抗人TS單克隆抗體，并采用PBS沖洗2次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素工作液，于37℃下孵育25 min，采用PBS液沖洗2次，經(jīng)DAB染色，蘇木素復(fù)染，采用中性樹(shù)膠封固。

1.2.3 結(jié)果判斷 根據(jù)病理切片染色面積及深度對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。染色深度評(píng)分:0分顯色不清或不顯色;1分土黃色;2分棕黃色;3分褐黃色。染色面積:0分0%且≤5%，1分為＞5%且≤35%，2分＞35%～65%;3分＞65%。染色深度與面積相加/2則為平均分，其中1分(+)為0.5～1;2分()為1.5～2.0;3分()為2.5～3.0。

1.3 4、5-二甲基噻唑-2(MTT)法檢測(cè)敏感性

1.3.1 主要試劑 0.9%氯化鈉溶液(廣州百特醫(yī)療用品有限公司);0.25%胰蛋白酶消化液(北京紐因華信科技發(fā)展有限公司);苔盼藍(lán)(北京中生瑞泰科技有限公司)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果判斷 取腫瘤組織約1 g，采用0.9%氯化鈉溶液漂洗2次，剪碎腫瘤，加入0.25%胰蛋白酶消化液，經(jīng)200目濾篩過(guò)濾，并制成單細(xì)胞懸浮液。采用苔盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞，并采用完全培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/ml，并將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μl。將孔板分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組，實(shí)驗(yàn)組中加入5-Fu，20 μl/孔，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，空白組不加入細(xì)胞懸浮液，只加入PBS。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h，并于每個(gè)培養(yǎng)孔中加入20 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，并加入150 μl二甲基亞礬(DMSO)，輕輕震蕩充分搖勻，并采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度(OD)值，并計(jì)算抑制率(CI)。當(dāng)CI≥30%為敏感，CI＜30%為不敏感。

1.4 療效評(píng)價(jià) ①近期療效:根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、病情穩(wěn)定(SD)、疾病進(jìn)展(PD)。其中CR+PR為總有效率(RR)。②化療毒副反應(yīng):參照世界衛(wèi)生組織(WHO)抗癌藥物急性及亞急性毒性分級(jí)0～Ⅳ度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TS在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況 結(jié)直腸癌組織中TS陽(yáng)性表達(dá)率〔74.36%(58/78)〕顯著高于正常癌旁組織〔10.26%(8/78)〕(χ2=7.852，P=0.002)。

2.2 TS陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 TS表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)、分化程度、浸潤(rùn)程度有關(guān)(P＜0.01)，而與性別、年齡、腫瘤分型、腫瘤大小、TNM分期無(wú)關(guān)(P ＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 TS陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3 TS陽(yáng)性表達(dá)與不良反應(yīng)的關(guān)系 TS陽(yáng)性表達(dá)患者惡心嘔吐、骨髓抑制、腹瀉、口腔黏膜炎化療毒副反應(yīng)等級(jí)顯著高于TS陰性患者(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 TS陽(yáng)性表達(dá)與不良反應(yīng)的關(guān)系(n)

2.4 TS陽(yáng)性表達(dá)與近期化療效果及敏感率的關(guān)系 患者均順利完成化療，TS陽(yáng)性表達(dá)患者化療總有效率、化療敏感率顯著高于TS陰性患者(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 TS陽(yáng)性表達(dá)與近期化療效果及敏感率的關(guān)系〔n(%)〕

3 討論

TS是胸苷酸合成限速酶，通過(guò)抑制TS生成能有效抑制DNA的生物合成，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖〔5〕。5-Fu可通過(guò)抑制TS生成而發(fā)揮抗癌活性，TS被認(rèn)為是5-Fu及其衍生物殺滅癌細(xì)胞的靶點(diǎn)〔6〕。本研究提示TS表達(dá)水平升高與結(jié)直腸癌的發(fā)生具有密切關(guān)系。Negri等〔7〕檢測(cè)了接受5-Fu化療后發(fā)生轉(zhuǎn)移的大腸癌患者TS表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TS水平與生存期呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。本研究進(jìn)一步論證了TS表達(dá)水平可作為臨床結(jié)直腸癌患者化療藥物選擇的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

盡管5-Fu是結(jié)直腸癌化療中首選的藥物，但由于個(gè)體差異，并不是所有患者都對(duì)5-Fu敏感，不同個(gè)體間存在顯著差異，甚至個(gè)別病例可發(fā)生血液學(xué)毒性及致死性消化道不良反應(yīng)〔8〕。張婷婷等〔9〕應(yīng)用DNA芯片對(duì)5-Fu耐藥的癌細(xì)胞株進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)TS過(guò)度表達(dá)。任建林等〔10〕對(duì)5-Fu類(lèi)藥物作用機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，TP不僅是5-Fu及其前體藥物的催化酶，同時(shí)還具有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用，TS在腫瘤組織侵犯轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要的作用。本研究提示TS過(guò)度表達(dá)可影響5-Fu類(lèi)藥物化療敏感率，從而影響患者治療效果。這可能與如下因素有關(guān):①TS高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA合成，從而加速腫瘤細(xì)胞增殖，加速患者病情進(jìn)展。②TS作為5-Fu類(lèi)藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其表達(dá)水平增高，表明該靶點(diǎn)對(duì)化療的敏感性下降，產(chǎn)生了耐藥性，因此化療效果較差。

本研究結(jié)果與何瓊等〔11〕及Avallone等〔12〕研究結(jié)果一致，研究結(jié)果均表明T分期或M分期越高的患者的患者，TS mRNA的表達(dá)水平越高。由于TS與血小板內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子屬于同一類(lèi)物質(zhì)，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)劃移動(dòng)來(lái)刺激血管生成的作用。TS表達(dá)水平增加表面血管生長(zhǎng)及侵襲性更強(qiáng)，患者惡性程度更高，因此通過(guò)測(cè)定腫瘤TS中的表達(dá)水平可有效預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者病情進(jìn)展及惡性情況。5-Fu在體內(nèi)可被二氫尿嘧啶脫氫酶(DPD)轉(zhuǎn)化生成5-氟二氫尿嘧啶排出體外，而TS可抑制DPD表達(dá)水平，當(dāng)TS活性及表達(dá)水平增加時(shí)可影響DPD合成，降低DPD活性，使得血漿中5-Fu不能及時(shí)排出體外，導(dǎo)致5-Fu在血漿中大量蓄積，從而引起患者出現(xiàn)胃腸道及血液毒性，增加患者毒副反應(yīng)〔13〕。本研究表明TS表達(dá)水平與5-Fu毒副反應(yīng)有密切的關(guān)系?？筛鶕?jù)TS與5-Fu化療敏感性及毒副反應(yīng)情況，在毒副反應(yīng)中應(yīng)篩選出TS陽(yáng)性表達(dá)患者，并調(diào)整5-Fu化療方案及劑量，從而提高患者化療效果。

綜上，TS高表達(dá)水平與直腸癌發(fā)生及病情進(jìn)展具有密切的關(guān)系。直腸癌組織中TS表達(dá)可作為患者化療敏感性、化療副反應(yīng)及預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

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