甘露醇凝集素系統(tǒng)及其細(xì)胞因子與糖尿病腎病發(fā)病的關(guān)系

秦建華 張 帆 李 瑩 劉 進(jìn) 劉 琦 歐三桃 吳蔚樺

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者體內(nèi)存在甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)水平明顯升高，且與患者的死亡率呈正相關(guān)〔1，2〕，因此推測(cè)糖尿病腎病(DN)發(fā)病可能與MBL途徑補(bǔ)體激活有關(guān)。細(xì)胞因子通過介導(dǎo)一些急性反應(yīng)，在DN的發(fā)展過程中同樣發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞因子作為天然免疫的主要組成部分，盡管作用機(jī)制都不盡相同，但近年來的研究表明，DN的病程發(fā)展與多種細(xì)胞因子有關(guān)〔3〕。本研究通過比較DN患者血漿MBL及其補(bǔ)體CD59、細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、IL-17和IL-23含量變化，分析DN可能的免疫發(fā)病機(jī)制，為DN的診斷及治療提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年9～12月于我院腎內(nèi)科就診的80例DN患者為實(shí)驗(yàn)組，均符合DN的早期腎病或臨床腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)，男46例，女34例;年齡40～75歲，平均55歲;病程5～20年，平均 15.7年;收縮壓 140～175 mmHg，舒張壓 90～130 mmHg;尿白蛋白排泄量60～400 mg/24 h。按照尿白蛋白排泄率(UAER)分為正常白蛋白尿組(NA，UAER＜30 mg/24 h，n=26)、微量白蛋白尿組(MA，UAER 30～300 mg/24 h，n=33)和臨床蛋白尿組(CA，UAER＞300 mg/24 h，n=21)。選取120例來院體檢的健康老年人為對(duì)照組，男62例，女58例，平均年齡(64.96±8.28)歲，收集相應(yīng)標(biāo)本的詳細(xì)病例資料，病例均無血糖偏高、肝腎功能以及自身免疫疾病等。兩組年齡、性別、病情程度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究取得所有受試者的知情同意。

1.2 觀測(cè)指標(biāo) 觀測(cè)兩組人群的外周血MBL，肝腎功，血脂，細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-17、IL-23及24 h尿蛋白、尿蛋白排泄率等指標(biāo)。

1.3 方法 ①標(biāo)本收集及一般性指標(biāo)的檢測(cè):測(cè)量患者血壓。過夜禁食后次晨空腹肘靜脈采血，測(cè)定血清肌酐(SCr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-17和IL-23。②尿白蛋白測(cè)定:留尿當(dāng)天清晨排空膀胱，棄去尿液，收集至次日晨24 h尿，測(cè)定尿總量，混勻后留取部分尿液測(cè)定尿蛋白，計(jì)算出UAER，全部對(duì)象均不連續(xù)測(cè)定2次，取平均值。③所有患者清晨空腹肘靜脈采血，按試劑盒要求分離血清，保存于－70℃冰箱。收集晨尿標(biāo)本，用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清MBL和尿膜攻擊復(fù)合物(MAC)。相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-17和IL-23含量的測(cè)定采用ELISA法。試劑盒購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清MBL及尿MAC的表達(dá)水平分析 血清MBL及尿MAC的表達(dá)均與患者的UAER呈正相關(guān)性(R2=0.894，0.908;P＜0.05)。CA組SCr、UAER均明顯高于NA組和MA組，MA組SCr、UAER高于NA組。CA組的血清MBL濃度以及尿MAC濃度明顯高于MA組，MA組也高于NA組(均P＜0.05)，見表1，圖1。

2.2 兩組血清細(xì)胞因子含量的結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)組血漿IL-6含量高于對(duì)照組(P＜0.05)，血漿IL-8含量兩組相比無顯著差異(P ＞0.05)，見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果(±s)

表1 實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果(±s)

與NA組比較:1)P＜0.05

組別 n Scr(mmol/L)UAER(mg/24 h)MBL(μg/L)MAC(pg/L)26 80.32±9.87 20.4±6.8 560±110 42±11 MA組 33 98.54±11.231)110.2±25.71)970±3491) 102±401)CA組 21 120.37±29.31)900.3±119.81)1 110±4201)160±301)NA組

圖1 患者UAER與血清MBL及尿MAC的相關(guān)性

表2 兩組細(xì)胞因子含量的檢測(cè)結(jié)果(±s，ng/L)

表2 兩組細(xì)胞因子含量的檢測(cè)結(jié)果(±s，ng/L)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05

IL-6 IL-8 IL-17 IL-23實(shí)驗(yàn)組 80 547±1091)1 235±3061)270±1101)2 320±8101)組別 n對(duì)照組120 430±112 1 290±257 145±49 1 727±879

2.3 兩組單核細(xì)胞MBL補(bǔ)體CD59分子檢測(cè) 通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)對(duì)照組單核細(xì)胞CD59陽性的單核細(xì)胞比例為23.17%～47.55%，實(shí)驗(yàn)組 CD59陽性的單核細(xì)胞比例為64.36%～94.39%，兩組在CD59表達(dá)陽性的單核細(xì)胞比例上有明顯差異(P＜0.01)。同時(shí)，Western檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組CD59的表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，平均為對(duì)照組的4.5倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，見圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)MBL補(bǔ)體CD59的表達(dá)

3 討論

DN是糖尿病的重要微血管并發(fā)癥，大規(guī)模調(diào)查研究顯示亞洲人群2型糖尿病患者中DN發(fā)生率高，盡管目前加強(qiáng)了血糖管理，但仍有58.6%的糖尿病患者逐漸進(jìn)展為臨床蛋白尿并出現(xiàn)腎功能受損〔4〕，因此DN的發(fā)病機(jī)制成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，正常蛋白尿組的1型糖尿病患者比非糖尿病組的MBL水平要高，而伴有腎臟病變或已有微量蛋白尿者血清MBL水平則高于正常蛋白尿組。在高M(jìn)BL基因表達(dá)水平和高循環(huán)MBL水平的患者，DN更為盛行〔5，6〕。這些證據(jù)為科學(xué)家們提供了進(jìn)一步研究DN發(fā)病機(jī)制的新思路。

MBL為主要由肝細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的一種血清糖蛋白，是天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，是補(bǔ)體激活凝集素途徑的起動(dòng)因子。MBL在結(jié)合病原微生物表面的N氨基半乳糖或甘露糖等糖基配體后按照級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)依次裂解補(bǔ)體，最終形成MAC，完成補(bǔ)體激活過程。MBL通過識(shí)別微生物表面糖蛋白來激活補(bǔ)體，并受CD59等補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控，因此一般不會(huì)發(fā)生自身損傷性MAC的形成〔7〕。但某些情況下也具有潛在的自身活性，例如缺血再灌注后氧化應(yīng)激可改變細(xì)胞表面糖基化狀態(tài)而致MBL沉積增加和補(bǔ)體激活〔8〕。高血糖也可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過非酶糖基化等途徑促使細(xì)胞表面糖基化改變，推測(cè)正是通過此途徑導(dǎo)致MBL沉積和補(bǔ)體激活，以解釋糖尿病如何受高M(jìn)BL的影響。

研究發(fā)現(xiàn)在1型糖尿病患者中，MBL的基因表達(dá)及平均血清濃度明顯高于正常蛋白尿組，甚至同卵雙生患者中，DN組的平均血清MBL濃度也高于正常蛋白尿組〔9〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)MBL可以明顯影響糖尿病小鼠的腎臟重量、尿自蛋白排泄量和膠原IVal mRNA的表達(dá)，DN大鼠腎臟中存在MBL-A的沉積增加〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在我國2型糖尿病患者體內(nèi)存在血清MBL濃度升高，經(jīng)腎臟排出的MAC也明顯增加，患者體內(nèi)發(fā)生了MBL途徑補(bǔ)體激活。另外隨著血清MBL和尿MAC水平的升高，患者尿蛋白逐漸增加，腎臟功能逐漸惡化，MBL濃度與患者腎臟病變的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。本研究顯示了MBL獨(dú)立于其他因素之外的致病作用。

細(xì)胞因子通過介導(dǎo)一些急性反應(yīng)，在DN的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。IL-6是一種常見的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)肝臟合成炎性蛋白質(zhì)，刺激血管內(nèi)皮釋放細(xì)胞因子，增加血管通透性，導(dǎo)致血管的早期損傷，IL-6過多會(huì)使肝臟CRP的合成增加，加重炎性反應(yīng)〔11〕。姜曉艷等〔12〕認(rèn)為IL-6與2型糖尿病大血管病變的發(fā)生相關(guān)，本研究與上述研究結(jié)果一致。IL-8是一種可以加強(qiáng)中性粒細(xì)胞吞噬功能和殺傷能力的炎性遞質(zhì)。本研究說明患者存在炎癥反應(yīng)，這與國內(nèi)其他研究結(jié)果相一致。IL-8含量增高可能是由于2型糖尿病病程進(jìn)展中對(duì)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞刺激造成的，反過來產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子又對(duì)胰島功能造成損害，加速病程的發(fā)展。IL-17是一種有強(qiáng)烈致炎作用的細(xì)胞因子〔13〕，多種免疫相關(guān)的疾病與IL-17相關(guān)。IL-23是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，近年來與糖尿病的關(guān)系也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者中IL-23升高，并且并不通過誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素-1來產(chǎn)生胰島素抵抗作用。Abbasi等〔14〕也觀察到在不同類型糖尿病患者中，均存在IL-23升高的情況。本研究提示IL-23在DN病程發(fā)展中起著重要作用。

綜上所述，我國DN者體內(nèi)可能存在血清MBL及細(xì)胞因子升高，通過激活凝集素補(bǔ)體途徑及急性反應(yīng)導(dǎo)致DN發(fā)生和進(jìn)展。高血清MBL及相關(guān)細(xì)胞因子可以作為糖尿病腎臟損害的預(yù)報(bào)因子。

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