文冠果果殼皂甙的分離純化及其抗氧化活性研究

許柏艷,李 僉,*,田 晶,*,徐龍權

(1.大連工業(yè)大學 生物工程學院,遼寧大連 116034;2.大連工業(yè)大學 現代教育技術部,遼寧大連 116034)

文冠果果殼皂甙的分離純化及其抗氧化活性研究

許柏艷1,李 僉1,*,田 晶1,*,徐龍權2

(1.大連工業(yè)大學 生物工程學院,遼寧大連 116034;2.大連工業(yè)大學 現代教育技術部,遼寧大連 116034)

采用AB-8大孔樹脂對文冠果果殼皂甙進行純化,研究了上樣液質量濃度、乙醇體積分數、洗脫液流速和氫氧化鈉質量分數對純化效果的影響,進一步通過正交實驗獲得最佳工藝條件。實驗結果表明,當上樣液質量濃度為30 g/L,乙醇體積分數為70%,洗脫液流速為2.0 BV/h,氫氧化鈉質量分數為0.20%時,純化后的文冠果果殼皂甙純度為67.81%,回收率為64.04%,并具有較強的抗氧化活性,能夠有效清除DPPH自由基。

文冠果果殼皂甙,AB-8大孔樹脂,純度,回收率,抗氧化活性

文冠果,別名木瓜、文官果、僧燈毛道,是我國特有的珍稀木本油料作物,為無患子科文冠果屬,分布于遼寧、河北、陜西等省,其干燥莖、枝能祛風除濕,消腫止痛,主要用于治療風濕性關節(jié)炎等疾病,已列入《中華人民共和國藥典》[1]。文冠果果殼是文冠果進行油品加工后的主要廢棄物,含有大量五環(huán)三萜類皂甙成分。與大多數皂甙的理化性質類似,文冠果果殼皂甙也是糖的衍生物,具有結構復雜,分子量較大,不易結晶,易吸潮,有苦味或辛辣味等特點;同時極性較大,易溶于熱水、熱乙醇、甲醇、正丁醇,難溶于丙酮、乙醚、乙酸乙酯等有機溶劑,并且具有發(fā)泡性、溶血性和顯色性。文獻報道,文冠果果殼皂甙在抗炎、抗腫瘤、抑制HIV蛋白酶、改善學習記憶等方面具有獨特的藥理特性[2-4],因此文冠果果殼資源的深度開發(fā)與高值化利用對食品、藥品及保健品行業(yè)的發(fā)展具有非常重要的意義。

目前,皂甙的分離純化方法主要有萃取法、硅膠柱層析法以及大孔吸附樹脂法。萃取法需要使用大量的有機溶劑并且分離純度不高[5],而硅膠柱層析法對原料的預處理要求較為苛刻,分離成本也較高[6]。與之相比,大孔吸附樹脂法作為一種簡便高效的方法,近來已被廣泛地應用于分離純化人參皂甙[7]、大豆皂甙[8]、黃芪皂甙[9]、苦瓜皂甙[10]、豆角皂甙[11]等,純化率達54.61%～69.04%,并且具有穩(wěn)定性高、選擇性強、解吸條件溫和、成本低廉、無污染、可再生等優(yōu)點[12]。大孔吸附樹脂應用于皂甙類成分的富集純化具有很好的效果,但其吸附性能及其解吸、純化條件參數因所分離物質的理化性質不同而不同[13]。本文以文冠果果殼為實驗原料,采用AB-8大孔吸附樹脂對文冠果果殼皂甙的分離純化工藝進行深入研究,進一步分析了文冠果果殼皂甙對DPPH自由基的清除能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

文冠果果殼 內蒙古赤峰林場;AB-8大孔樹脂 南開大學化工廠;齊墩果酸 大連美侖生物技術有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 西安沃爾森生物技術有限公司;抗壞血酸(VC)、香草醛、濃硫酸、正丁醇 天津市科密歐化學試劑有限公司;乙酸乙酯、氫氧化鈉 天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠;鹽酸 遼寧新興試劑有限公司;甲醇 北京化工廠;無水乙醇 大連市酒精廠。

T500型電子天平 美國雙杰兄弟(集團)有限公司;RE-52旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;Lambda-35型紫外分光光度計 美國PE公司;HH-8數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;SHZ-D真空抽濾泵 鞏義市英峪華儀器廠;TGL-16G高速離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 以齊墩果酸為標準物,采用香草醛-硫酸法于537 nm處進行測定[14]。

1.2.2 文冠果果殼粗皂甙的提取 用微型植物粉碎機將文冠果果殼粉碎并過20目篩。用電子天平稱取干燥至恒重的文冠果果殼粉末200.0 g,置于5000 mL三角瓶中,加入70%的乙醇溶液1400 mL,在70 ℃下加熱回流提取4 h;然后用布氏漏斗進行抽濾,將濾液減壓蒸餾回收乙醇至20%,室溫靜置過夜;過濾除去膠質,繼續(xù)回收乙醇得浸膏26.0 g。將浸膏8倍水量溶解,3500 r/min離心分離15 min,取上清液。加入等體積的乙酸乙酯萃取2～3次,靜置,待明顯分層后,取下層液,稱為萃取液A;向萃取液A中加入等體積的水飽和正丁醇萃取2～3次,靜置,待分層后,取上層液,稱為萃取液B;將萃取液B倒入500 mL燒瓶中,置于旋轉蒸發(fā)儀上,70 ℃下旋轉蒸發(fā),進一步烘干后得到粗皂甙粉末[15-16]。用電子天平準確稱量,得到的粗皂甙粉末為5.275 g。依此計算:文冠果果殼皂甙得率(%)=粗皂甙粉末質量(g)/文冠果果殼粉末質量(g)×100。

1.2.3 文冠果果殼皂甙分離純化工藝研究

1.2.3.1 單因素實驗 分別配制濃度為10、20、30、40、50 g/L的文冠果果殼粗皂甙溶液,在樹脂分離柱中吸附平衡2 h后,用0.2% NaOH溶液洗柱,除去樣品中可能存在的單寧、黃酮等雜質;再用去離子水洗柱至流出液呈中性;最后用80%的乙醇以2 BV/h的流速洗柱,將皂甙完全洗脫,收集洗脫液,確定最佳上樣液濃度。其它操作條件不變,分別考察體積分數為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液對文冠果果殼皂甙分離純化過程的影響。進一步研究洗脫液流速為1、1.5、2、2.5、3 BV/h時對皂甙純化過程的影響。在此基礎上,采用質量濃度為0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%的NaOH溶液洗柱,考察不同濃度的NaOH溶液對皂甙純化過程的影響。

1.2.3.2 正交實驗 在單因素實驗基礎上,進一步采用L9(34)正交表(表1),確定各因素的實驗水平,對文冠果果殼皂甙純化過程進行研究。每個實驗平行測定3次,從而確定文冠果果殼皂甙的最佳分離純化工藝條件。

表1 正交實驗因素與水平表

1.2.4 文冠果果殼皂甙含量、純度及回收率的計算 準確稱取文冠果果殼粗皂甙20 mg,置于10 mL容量瓶中,加入適量甲醇使其完全溶解,定容至刻度并搖勻,根據1.2.1中的標準曲線計算皂甙含量及純度。

在AB-8大孔樹脂分離純化文冠果果殼皂甙的實驗中,準確移取100 μL洗脫液,按照1.2.1方法測定皂甙的質量濃度C1(g/L),并乘以洗脫液體積V1(L)得到純化后的總皂甙質量(g),再根據洗脫液干燥至恒重后的質量m1(g)、上樣液中文冠果果殼皂甙的質量濃度C0(g/L)和上樣液體積V0(L),即可計算出經大孔樹脂分離純化后文冠果果殼皂甙的純度P和回收率R:

P(%)=(C1×V1)/m1×100

式(1)

R=(C1×V1)/(C0×V0)

式(2)

1.2.5 文冠果果殼皂甙的DPPH清除活性分析 準確稱取DPPH 25.8 mg,用無水甲醇定容至100 mL,得到質量濃度為0.258 g/L的DPPH母液,再稀釋成質量濃度為0.0515 g/L的DPPH標準溶液,避光備用。取不同質量濃度的純化后文冠果果殼皂甙溶液,并以VC為陽性對照,根據文獻方法計算出其對DPPH自由基的清除率[17-18]。為了便于比較二者抗氧化活性的強弱,選用IC50值(清除率為50%時的質量濃度值)作為其清除DPPH自由基能力的測定指標,IC50值越小,說明對DPPH自由基的清除能力越強。

1.3 數據統(tǒng)計分析

所有實驗至少重復3次,采用SPSS 17.0進行實驗設計和數據分析,并用Origin 7.5科學繪圖軟件進行制圖。

2 結果與討論

2.1 文冠果果殼皂甙測定的標準曲線

標準曲線為y=0.0055x-0.0090,R2=0.9985,x為齊墩果酸標準品質量濃度(μg/mL),y為吸光值。

2.2 文冠果果殼皂甙的含量及純度

采用乙醇回流法提取文冠果果殼皂甙,得率為2.64%,純度為30.31%,文冠果果殼皂甙含量為0.80%,與文獻報道的文冠果果殼總皂甙含量基本一致[15-16,19-20]。

2.3 單因素實驗

2.3.1 上樣液質量濃度對文冠果果殼皂甙純化效果的影響 如圖1所示,隨著上樣液質量濃度的增加,文冠果果殼皂甙的純度和回收率均呈現先增后減的規(guī)律,且都在30 g/L時達最大值。這主要是由于,上樣液質量濃度較低時,皂甙分子容易被樹脂吸附,使純度和回收率增大;而上樣液質量濃度過高時,樹脂表面過量吸附的一些分子,會阻礙部分皂甙分子進入樹脂內部,從而導致吸附率下降,使純度和回收率有所降低[21]。據此選擇上樣液質量濃度30 g/L為較適宜的操作條件。

圖1 上樣液質量濃度對皂甙純化的影響Fig.1 Effect of sample solution concentrationon saponin purification

2.3.2 乙醇體積分數對文冠果果殼皂甙純化效果的影響 由圖2可知,隨著乙醇體積分數的增加,大孔樹脂吸附的皂甙更容易被洗脫下來,因此皂甙的純度和回收率逐漸升高。當乙醇體積分數達到80%時,皂甙的回收率和純度都達最大值,分別為54.90%和58.13%。進一步增加乙醇體積分數,由于一些吸附在樹脂上的非極性成分也被洗脫下來,會使皂甙純度和回收率均有所降低[22]。因此,選擇80%為較適宜的乙醇體積分數。

圖2 乙醇體積分數對皂甙純化的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fractionon saponin purification

2.3.3 洗脫液流速對文冠果果殼皂甙純化效果的影響 如圖3可以看出,洗脫液流速在一定程度上會影響皂甙的洗脫程度。較慢的流速可以使皂甙分子充分地溶于洗脫液中,使總體洗脫量增加,進一步提高回收率和純度。當流速繼續(xù)增大時,部分皂甙分子可能來不及被洗脫液洗脫,仍吸附在樹脂柱上,導致回收率和純度降低。綜合考慮純度和回收率兩個因素,確定較適宜的洗脫液流速為2.0 BV/h。

圖3 洗脫液流速對皂甙純化的影響Fig.3 Effect of eluent flow rate on saponin purification

2.3.4 NaOH質量分數對文冠果果殼皂甙純化效果的影響 如圖4可知,NaOH質量分數較低時,粗皂甙中可能含有的單寧和黃酮等雜質解離不完全,仍吸附在樹脂上,導致皂甙分子在樹脂表面的吸附量下降,回收率較低;進一步用乙醇洗脫時,這些雜質也被一同洗脫下來,因此純化效果較差;當NaOH質量分數較高時,由于單寧和黃酮類物質完全解離,呈離子化狀態(tài)而被洗脫除去,同時部分皂甙分子也被洗脫下來,所以回收率和純度都降低[22]。綜合考慮回收率和純度,確定較適宜的NaOH質量分數為0.20%。

圖4 NaOH質量分數對皂甙純化的影響Fig.4 Effect of NaOH mass fraction on saponin purification

2.4 正交實驗結果與分析

在單因素實驗基礎上,采用L9(34)正交設計方法,實驗結果如表2所示。

對于文冠果果殼皂甙的分離純化過程,希望能兼顧產品純度和回收率。由表2中的正交實驗結果,綜合考慮純度以及回收率,使其權重各占50%,通過綜合得分(Total Points,TP)確定較優(yōu)的分離純化條件為A2B1C2D3,此時文冠果果殼皂甙的純度為66.26%,回收率為62.58%。

根據表2的極差分析可知,文冠果果殼皂甙純化效果影響因素的主次關系分別為,A>B>D>C,并且A2B1C2D2為較好條件,通過實驗得出該操作條件下文冠果果殼皂甙的純度為67.81%,回收率為64.04%,均高于正交實驗A2B1C2D3的結果。進一步由表3的方差分析結果可知,因素A、B、D均對文冠果果殼皂甙的純化過程有顯著性影響,而因素C對該過程無顯著性影響。

表2 正交實驗結果

注:
注:TP=(Pi/Pmax×50%+Ri/Rmax×50%)×100,i=1,2,3……9。

表3 正交實驗方差分析表

注:
注:α為F0.05(2,2)=19.0。

綜上所述,采用AB-8大孔樹脂分離純化文冠果果殼皂甙的最佳工藝條件為A2B1C2D2,即上樣液質量濃度為30 g/L,乙醇體積分數為70%,洗脫液流速為2.0 BV/h,NaOH質量分數為0.20%,此時文冠果果殼皂甙的純度為67.81%,回收率為64.04%。

2.5 文冠果果殼皂甙的DPPH清除活性分析

實驗結果如圖5所示，由圖5可以看出,隨著文冠果果殼皂甙質量濃度的增加,其對DPPH自由基的清除率逐漸增大,說明皂甙質量濃度與抗氧化活性存在一定的量效關系。當質量濃度較低時,文冠果果殼皂甙的抗氧化活性較弱,其對DPPH自由基的清除率為相同濃度VC清除能力的29%～67%。當文冠果果殼皂甙質量濃度增加至2.0 g/L時,對DPPH自由基的清除率可達90.17%。進一步得出VC和文冠果果殼皂甙的IC50值分別為0.154 g/L和0.41 g/L,說明純化后的文冠果果殼皂甙具有較強的清除DPPH自由基的能力。

圖5 純化后文冠果果殼皂甙與VC對DPPH自由基的清除率Fig.5 Comparison of DPPH free radical scavenging activitybetween purified X. sorbifolia husk saponin and VC

3 結論

本實驗采用乙醇回流法提取文冠果果殼皂甙,得率為2.64%,皂甙含量為0.80%。利用AB-8大孔樹脂對文冠果果殼皂甙進行分離純化,獲得最佳純化工藝條件為:上樣液質量濃度30 g/L,乙醇體積分數70%,洗脫液流速2.0 BV/h,NaOH質量分數0.20%。純化后文冠果果殼皂甙的純度為67.81%,是純化前皂甙純度的2.24倍,同時皂甙的回收率可達64.04%。實驗結果表明,VC和文冠果果殼皂甙的IC50值分別為0.154 g/L和0.41 g/L,說明純化后的文冠果果殼皂甙具有較強的清除DPPH自由基的能力。這將為文冠果果殼的資源化利用及其在食品、保健品行業(yè)的深入開發(fā)提供基礎數據。

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Study on purification of the saponin fromXanthocerassorbifoliahusk and analysis of the antioxidant activity

XU Bai-yan1,LI Qian1,*,TIAN Jing1,*,XU Long-quan2

(1.School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.Modern Education Technical Department,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

AB-8 macroporous resin was used for the separation and purification of theX.sorbifoliahusk saponin,and the effects of sample solution concentration,ethanol volume fraction,eluent flow rate and NaOH mass fraction were examined for the orthogonal design. Furthermore,the operating parameters were optimized to an overall consideration of purity and recovery,when the sample solution concentration was 30 g/L,ethanol volume fraction was 70%,eluent flow rate was 2.0 BV/h and NaOH mass fraction was 0.20%,the purity of theX.sorbifoliahusk saponin was 67.81%,and the recovery ratio was 64.04%. Besides,the antioxidant activity of theX.sorbifoliahusk saponin was analyzed,and it was indicated that the purifiedX.sorbifoliahusk saponin could effectively scavenge DPPH free radical.

saponin of theX.sorbifoliahusk;AB-8 macroporous resin;purity;recovery ratio;antioxidant activity

2014-10-08

許柏艷(1989-)，女，碩士研究生，主要從事天然活性產物分離及生物轉化方面的研究，E-mail:xu005693@126.com。

*通訊作者:李僉(1982-)，女，博士，講師，研究方向：生物催化與生物分析，E-mail：liqian19820903@163.com。 田晶(1966-)，女，博士，教授，研究方向：生物催化與生物分析，E-mail：tianjing@dlpu.edu.cn。

遼寧省自然科學基金(2013020167)。

TS209

B

1002-0306(2015)15-0252-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.044