響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取藍(lán)莓葉多酚

李穎暢,張明輝,馬春穎,李作偉,李秀霞,張 笑

(1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院,遼寧錦州 121013;2.遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧錦州 121013;3.遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”,遼寧錦州 121013)

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取藍(lán)莓葉多酚

李穎暢1,2,3,張明輝1,馬春穎1,李作偉,李秀霞1,2,3,張 笑1,2,3

(1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院,遼寧錦州 121013;2.遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧錦州 121013;3.遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”,遼寧錦州 121013)

以藍(lán)莓葉粉末為材料,以超聲波輔助乙醇提取藍(lán)莓葉多酚,研究超聲時間、超聲功率、乙醇濃度、料液比對藍(lán)莓葉多酚得率的影響,并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波輔助乙醇提取藍(lán)莓葉多酚的工藝條件。結(jié)果表明:超聲時間10 min,超聲功率546 W,乙醇濃度64%,料液比1∶22(g/mL),藍(lán)莓葉多酚得率為8.54%。超聲波輔助提取法操作簡便、得率高,是適合藍(lán)莓葉多酚提取的一種工藝方法。

藍(lán)莓葉多酚,超聲波輔助法,提取工藝,響應(yīng)面設(shè)計

藍(lán)莓,又稱烏飯樹、越桔、藍(lán)漿果等,屬杜鵑花科越桔屬植物[1]。我國藍(lán)莓葉資源豐富,分布于全國各地。藍(lán)莓葉,一般為橢圓形或者長圓形,全綠,藥食兩用。藍(lán)莓葉中含有多糖、多酚類化合物、氨基酸、脂肪酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、有機酸、維生素、礦質(zhì)元素、甾醇和萜類等[2-3]。多酚又名單寧、鞣質(zhì),是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)的混合物,是分子中具有多個羥基酚類植物成分的總稱[4]。植物多酚具有抗氧化、清除自由基、增強免疫力、抗腫瘤和抗病毒等生物活性[5-9]。超聲波提取技術(shù)是指利用頻率高于20 kHz的聲波通過超聲波輻射壓強產(chǎn)生的機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)加快物質(zhì)的擴散溶解,有效提高化合物提取率[10]。超聲波具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點,適合熱敏物質(zhì)的提取。目前對藍(lán)莓的研究大多停留在藍(lán)莓果多酚的提取、生物活性等研究上,對藍(lán)莓葉多酚的研究還鮮有報道。本文采用超聲波輔助乙醇提取藍(lán)莓葉多酚,通過對藍(lán)莓葉多酚提取工藝中超聲時間、超聲功率、乙醇濃度、料液比等因素與藍(lán)莓葉多酚提取率關(guān)系的研究,結(jié)合響應(yīng)面法對藍(lán)莓葉多酚提取工藝進行優(yōu)化,旨在探求藍(lán)莓葉多酚提取的最佳工藝條件,為藍(lán)莓葉多酚的深加工提供一定的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓葉(栽培品種“藍(lán)豐”) 沈陽農(nóng)業(yè)科學(xué)發(fā)展研究院;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所;Folin-Ciocalteu試劑 上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;乙醇、無水碳酸鈉,分析純 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

萬能高速粉碎機 歐凱萊芙(香港)實業(yè)公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;722N可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;UV-1600型紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司;FA2004型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;Scientz-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚含量的測定 多酚含量的測定采用福林酚比色法[11]。多酚吸光度和多酚濃度的回歸曲線方程為y=0.0895x+0.0238(R2=0.9997),其中y是750 nm處多酚的吸光度,x是多酚濃度(mg/mL)。藍(lán)莓葉多酚的吸光度在750 nm處測定,多酚濃度根據(jù)回歸曲線方程計算,多酚得率根據(jù)以下公式計算。

多酚得率(%)=C×V×n×100/1000 m

其中:C是藍(lán)莓葉多酚濃度(mg/mL),V是提取樣品體積(mL),n是稀釋倍數(shù),m是藍(lán)莓葉的質(zhì)量(g)。

1.2.2 藍(lán)莓葉多酚超聲波輔助提取的單因素實驗

1.2.2.1 超聲時間對多酚得率的影響 稱取2.00 g藍(lán)莓葉粉末,在料液比1∶25(g/mL),乙醇濃度60%,超聲波功率400 W的條件下,考察提取時間分別為4、6、8、10、12 min對藍(lán)莓葉多酚得率的影響。

1.2.2.2 超聲功率對多酚得率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g藍(lán)莓葉粉末,在超聲時間8 min,乙醇濃度為60%,料液比1∶25(g/mL)條件下,考察超聲功率分別為200、300、400、500、600 W對藍(lán)莓葉多酚得率的影響。

1.2.2.3 乙醇濃度對多酚得率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g藍(lán)莓葉粉末,在超聲時間為8 min,超聲波功率400 W,料液比1∶25(g/mL)的條件下,考察乙醇濃度為20%、40%、60%、80%、100%對藍(lán)莓葉多酚得率的影響。

1.2.2.4 料液比對多酚得率的影響 準(zhǔn)確稱取2.00 g藍(lán)莓葉粉末,在超聲時間為8 min,超聲波功率為400 W,乙醇濃度為60%條件下,考察料液比為1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55(g/mL)對藍(lán)莓葉多酚得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理,設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取的工藝參數(shù),實驗因素與水平設(shè)計見表1。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SAS 8.0 軟件進行4因素3水平Box-Behnken實驗設(shè)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲時間對藍(lán)莓葉多酚得率的影響

從圖1可以看出,隨超聲時間的增加,藍(lán)莓葉多酚得率提高。當(dāng)超聲時間為8 min時,多酚的得率達(dá)到最大值,為6.69%。超聲時間為10、12 min多酚得率略有降低,但和超聲時間8 min相比,多酚得率無顯著性(p>0.05)差異。可能隨超聲時間的延長,超聲產(chǎn)生的熱量使提取液溫度升高,多酚有少量降解所致。石珂心等[12]超聲波輔助提取石榴籽多酚,超聲時間為31 min,本文提取藍(lán)莓葉多酚的超聲時間比提取石榴籽多酚短很多,可能是因為提取藍(lán)莓葉多酚的功率比石榴籽多酚的高,導(dǎo)致提取時間縮短,也可能是藍(lán)莓葉多酚比石榴籽多酚容易提取。利用超聲波提取多酚可大大節(jié)約提取時間,Porto等[13]發(fā)現(xiàn)用常規(guī)的浸提提取葡萄籽多酚時間為12 h,而用超聲波提取只需15 min。從節(jié)約時間和成本考慮,選擇提取藍(lán)莓葉多酚的超聲時間為8 min。

表1 藍(lán)莓葉多酚提取Box-Behnken實驗因素和水平

圖1 超聲時間對藍(lán)莓葉多酚得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on theextraction yield of polyphenols from blueberry leaves

2.2 超聲功率對藍(lán)莓葉多酚得率的影響

從圖2可以看出,隨超聲功率提高,藍(lán)莓葉多酚得率增加,這可能是由于超聲波空化作用加快藍(lán)莓葉細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破碎使藍(lán)莓葉多酚更容易被提取。d’Alessandro等[14]報道超聲波使植物樣品組織能吸收更多的溶劑而膨脹,使細(xì)胞壁孔隙增大。在超聲功率為500 W時,多酚得率達(dá)到最大值,之后超聲功率再提高,多酚得率略有降低。功率為600 W與500 W相比,多酚得率無顯著性(p>0.05)差異,說明當(dāng)超聲功率達(dá)到一定程度,產(chǎn)生的熱量,導(dǎo)致部分多酚氧化損失,此時繼續(xù)增加超聲功率,藍(lán)莓葉多酚得率無顯著增加,選擇超聲功率為500 W。

圖2 超聲功率對藍(lán)莓葉多酚得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on theextraction yield of polyphenols from blueberry leaves

2.3 乙醇濃度對藍(lán)莓葉多酚得率的影響

從圖3可以看出,隨乙醇濃度的提高,多酚得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。乙醇濃度為60%時,多酚的得率為6.69%;乙醇濃度為80%時,多酚的得率為4.66%;而乙醇的濃度為100%時,多酚的得率只有1.75%。這可能是因為乙醇濃度低時隨著乙醇濃度的增加,多酚類物質(zhì)在乙醇溶液中的溶解度增加,乙醇濃度超過60%后,溶劑與藍(lán)莓葉多酚之間的極性差距增大,導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的溶解度下降。最佳乙醇濃度為60%。

圖3 乙醇濃度對藍(lán)莓葉多酚得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration onthe extractionyield of polyphenols from blueberry leaves

2.4 料液比對藍(lán)莓葉多酚得率的影響

從圖4可以看出,隨著料液比的增加,多酚得率也隨之增加,當(dāng)料液比為1∶25(g/mL)時,多酚得率達(dá)到最高,再增加料液比多酚得率反而降低,這可能是因為溶劑過少,溶液容易達(dá)到飽和,有效成分難以提取完全,而溶劑過多,原料中的雜質(zhì)也會溶出,使多酚得率降低,同時也會增加成本。因此,最佳料液比為1∶25(g/mL)。這與鮑建峰等[15]超聲提取香榧假種皮中總多酚的料液比是一致的。

圖4 料液比對藍(lán)莓葉多酚得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on theextraction yield of polyphenols from blueberry leaves

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.5.1 模型的建立及其顯著性檢驗 采用SAS8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析,Box-Behnken的4因素3水平實驗共27個實驗點,前面24個是析因點,自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點,后面3個為零點,為區(qū)域的中心點,用以估計實驗誤差,每次所得藍(lán)莓葉多酚得率見表2,由Box-Behnken Design設(shè)計方案所得的實驗結(jié)果見表3。運用SAS程序?qū)憫?yīng)值進行回歸分析,經(jīng)回歸擬和后得到回歸方程:Y=6.47+0.54X1+0.28X2+0.24X3+0.24X4+0.63X1X2-0.3X1X3-0.19X1X4+0.16X2X3-0.96X2X4+0.18X3X4+0.15X12+0.27X22-0.62X32-0.16X42。對回歸方程系數(shù)進行顯著性檢驗,從表3可以看出,作用顯著的是X2、X3、X4,極顯著的是X1,X1X2、X2X4,X32。從F值可以看出,對于該模型來說,各因素對藍(lán)莓葉多酚得率的影響排序為:超聲時間(X1)>超聲功率(X2)>乙醇濃度(X3)>料液比(X4)。

表2 提取藍(lán)莓葉多酚Box-Behnken的實驗設(shè)計與結(jié)果

表3 提取藍(lán)莓葉多酚的方差分析

2.5.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化及模型驗證 從結(jié)果來看,僅X1X2、X2X4交互作用極顯著,其響應(yīng)曲面圖為圖5,圖6。圖5為超聲功率和超聲時間對藍(lán)莓葉多酚得率的影響,超聲功率和超聲時間對藍(lán)莓葉多酚得率的影響是顯著的,但超聲時間的等高線更加密集,說明超聲時間比超聲功率對藍(lán)莓葉多酚得率的影響更顯著。圖6為超聲功率和料液比對藍(lán)莓葉多酚得率的影響,超聲功率對藍(lán)莓葉多酚得率影響更顯著。

由SAS8.0軟件分析得到響應(yīng)面值最大時,X1、X2、X3、X4對應(yīng)的編碼值分別為0.99、0.92、0.40、-0.62,與之對應(yīng)的藍(lán)莓葉多酚超聲波輔助提取法的最佳工藝條件為:超聲時間9.89 min,超聲功率546 W,乙醇濃度64%,料液比1∶21.9(g/mL),此時,藍(lán)莓葉多酚的理論得率達(dá)到8.54%。

為檢驗響應(yīng)面的可靠性,采用得到的最佳提取工藝條件進行藍(lán)莓葉多酚超聲提取的驗證實驗,同時考慮實際操作的局限性,將工藝參數(shù)修正為超聲時間10 min,超聲功率546 W,乙醇濃度64%,料液比1∶22(g/mL)。在此修正條件下進行3次平行驗證實驗,實驗測得的藍(lán)莓葉多酚得率為8.42%,與理論預(yù)測值8.54%基本吻合,因此,采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實用價值。

圖5 超聲時間和超聲功率對多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface showing the effects ofultrasound time and ultrasound power on extraction rate ofpolyphenols from blueberry leaves

圖6 超聲功率和料液對多酚得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface for the effects ofultrasound power and the ratio of material and liquid onextraction rate of polyphenols from blueberry leaves

3 結(jié)論

3.1 應(yīng)用SAS8.0軟件,采用Box-Behnken Design建立了超聲時間X1、超聲功率X2、乙醇濃度X3、料液比X4與藍(lán)莓葉多酚得率之間數(shù)學(xué)模型為

Y=6.47+0.54X1+0.28X2+0.24X3+0.24X4+0.63X1X2-0.3X1X3-0.19X1X4+0.16X2X3-0.96X2X4+0.18X3X4+0.15X12+0.27X22-0.62X32-0.16X42,回歸分析表明,相關(guān)系數(shù)R2=0.90197,表明回歸模型顯著,擬合程度好,有實際應(yīng)用意義;通過顯著性檢驗,各因素對結(jié)果影響排序為:超聲時間(X1)>超聲功率(X2)>乙醇濃度(X3)>料液比(X4)。

3.2 通過單因素和響應(yīng)面實驗得到最佳超聲波提取條件為:超聲時間10 min,超聲功率546 W,乙醇濃度64%,料液比1∶22(g/mL)。在此條件下進行驗證實驗,得到藍(lán)莓葉多酚得率為8.42%,該值與理論預(yù)測值8.54%基本吻合,說明響應(yīng)面模型可預(yù)測理論得率并很好的應(yīng)用于藍(lán)莓葉多酚提取工藝條件的優(yōu)化。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction of polyphenols from blueberry leaves by response surface method

LI Ying-chang1,2,3,ZHANG Ming-hui1,MA Chun-ying1,LI Zuo-wei,LI Xiu-xia1,2,3,ZHANG Xiao1,2,3

(1.College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Jinzhou 121013,China;2.Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China;3.Engineering and Technology Research Center of Food Preservation,Processing and Safety Control of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China)

Polyphenols from blueberry leaves were extracted by ethanol and ultrasonic-assisted. The effects of ultrasonic time,ultrasonic power,ethanol concentration and ratio of solid-liquid on the extraction were studied. Extraction process of polyphenols from blueberry leaves was optimized by response surface method. The conditions of ultrasonic extraction were optimized by single factor and response surface method:ultrasound time 10 min,ultrasound power 546 W,the concentration of ethanol 64%,the solid-liquid ratio 1∶22(g/mL),the total polyphenols extacted in this condition was 8.54%. The ultrasonic assisted extraction is simple and high of extraction rate,so it is a suitable process for the extraction of polyphenols from blueberry leaves.

polyphenols from blueberry leaves;ultrasound-assisted;extraction technology;response surface design

2014-11-05

李穎暢(1973-),女,博士,副教授,主要從事農(nóng)、水產(chǎn)品貯藏加工與質(zhì)量安全控制方面的研究，Liyingchangsy@sina.com。

國家自然基金(31201308)。

TS209

B

1002-0306(2015)15-0234-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.040