應用16S rDNA全序列測序技術鑒定生鮮乳中的細菌種類

韓瑞芳,董曉敏,劉天明

(齊魯工業(yè)大學食品科學與工程學院,山東省微生物工程重點實驗室 山東濟南 250353)

應用16S rDNA全序列測序技術鑒定生鮮乳中的細菌種類

韓瑞芳,董曉敏,劉天明*

(齊魯工業(yè)大學食品科學與工程學院,山東省微生物工程重點實驗室 山東濟南 250353)

采用玻璃珠法提取生鮮乳中分離的34株細菌基因組DNA,用細菌通用引物(27f/1492r)PCR擴增16S rDNA片段并測序,與GenBank數(shù)據(jù)庫同源序列比對,系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析,并結合形態(tài)學和生理學特征確定了34株菌的種屬地位。結果表明,共鑒定出16個種屬。3個生鮮乳樣中細菌種類及其分布特點不同。其中1號樣有7種細菌,以Acinetobactersp.(不動桿菌屬)為主,2號樣有6種細菌,以Klebsiellasp.(克雷貝氏桿菌屬)為主,3號樣有6種細菌,分布較為分散。從致病性來看,分離菌株主要為條件致病菌或腐敗菌,無烈性致病菌。

生鮮乳,16S rRNA,細菌,鑒定

生鮮乳含有豐富的人體必需營養(yǎng)物質,常被作為各類乳品的加工原料或輔料。但生鮮乳在加工前的采、貯、運過程中易受到環(huán)境中各種微生物污染,極易引發(fā)食品安全事件。生鮮乳的衛(wèi)生監(jiān)控和微生物檢驗是保證乳品食用安全的第一道關口,對乳制品加工質量意義重大[1],因此,生鮮乳中微生物的群落結構及其生物多樣性的研究對食源性致病菌及其毒素的預防[2]具有指導意義。細菌鑒定主要有表型特征鑒定和基因型鑒定2種方法。傳統(tǒng)上對牛乳中微生物多樣性及其種類鑒定的方法一般采用表型特征鑒定,但此法存在操作步驟繁瑣、工作量大、周期長、某些檢測結果不穩(wěn)定等問題[3]。目前PCR技術、基因芯片、流式細胞技術等被廣泛用于乳品微生物的檢測和鑒定[4]。

核酸序列分析技術已經用于多種微生物的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分類[5],其中16S rDNA序列常被用于細菌鑒定[6]。Woese[7]及Olsen[8]基于16S rDNA的分析構建了全生命系統(tǒng)進化樹,該技術在微生物分類鑒定以及分子檢測中得到了廣泛應用,越來越多的細菌依據(jù)16S rDNA被精準鑒別或重新分類。該法操作簡便、快速、準確且靈敏,已被廣泛應用于醫(yī)療、食品行業(yè)致病菌種類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育及種群多樣性的研究[9-10]。

本研究以采自3家奶牛場的生鮮牛乳中分離得到的37株細菌為材料,玻璃珠法提取基因組DNA,用細菌通用引物(27f/1492r)PCR擴增16S rDNA,經與GenBank數(shù)據(jù)庫模式株序列進行同源比對分析,并構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結合形態(tài)學和生理學特征對受試菌株分類,查明生鮮乳中微生物的種類和分布特點。

表1 部分代表性菌株的形態(tài)特征

注:
注:表中的代表性菌株形態(tài)特征包含34株菌株的所有形態(tài)類型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮乳樣品取自3家奶牛養(yǎng)殖場(樣品編號為A、B、C),取樣容器使用前已滅菌,常規(guī)無菌操作,奶樣置于4 ℃冷藏備用。

細菌16S rDNA通用引物為27f(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492r(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)[11]。主要分子試劑購自上海生工生物公司。

E2000型光學顯微鏡 日本Nikon;DYY-12型電泳儀 北京六一;TC-XP型PCR擴增儀 杭州博日;TGL-16M型高速冷凍離心機 上海安亭;SX-300型凝膠成像系統(tǒng) 上海四星生物,等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離及形態(tài)學觀察 取1 mL生鮮乳用9 mL無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋。根據(jù)預實驗結果選取三個適宜稀釋度的菌液200 μL分別涂布于LB固體平板上,每一稀釋度做三個平行,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。待菌落長成后,挑取單菌落劃線純化多次,直至獲得純培養(yǎng)物,并編號保藏于4 ℃冰箱。觀察各菌株的平板菌落特征[12],以及在顯微鏡下菌體形態(tài)和染色特征,歸類分析。選取各類代表菌株供鑒定用。

1.2.2 基因組DNA的提取 玻璃珠法:參照王紅等[13]的方法提取供試菌株的基因組DNA。取過夜培養(yǎng)的菌液于EP管中,8000 r/min,離心1 min,棄上清;200 μL的TE重懸,離心棄上清;200 μL的破壁緩沖液重懸,將其轉移至含有玻璃珠的EP管中,再向其加入200 μL的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1,v/v),高速震蕩3 min;加入200 μL TE靜置5 min,4℃下10000 r/min離心10 min,將上層水相轉至另一EP管中;加入上層水相兩倍體積的預冷無水乙醇,再加入0.1倍體積的5 mol/L KAC溶液,輕輕混勻,-20 ℃放置20 min;12000 r/min,4 ℃離心10 min,棄上清,晾干,沉淀用200 μL TE緩沖液溶解;加入1 μL的RNA酶(20 mg/mL),和1 μL的蛋白酶K(20 mg/mL),各37 ℃水浴30 min;加入0.1倍體積的4 mol/L NH4AC及等體積的異丙醇,混勻后-20 ℃放置20 min,10000 r/min,離心10 min,棄上清;用預冷的70%乙醇200 μL洗滌兩次棄上清,晾干;用30 μL的TE溶解,將其置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和含量。

1.3 細菌16S rDNA的PCR擴增

細菌16S rDNA PCR擴增體系為50 μL。擴增程序為:95 ℃預變性5 min,(94 ℃變性30 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s)×36個循環(huán),72 ℃延伸10 min[14]。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產物純化后送至華大基因公司測序,并將所測34株菌株的16S rDNA序列提交GenBank庫(序列號列于表2)。

2 結果與分析

2.1 菌株細胞形態(tài)特征

受試菌株中7株為G+菌,27株為G-菌,菌落主要為乳白色,少數(shù)灰色和黃色,細胞形態(tài)主要呈桿狀、長桿狀,少數(shù)為球狀。

2.2 細菌基因組DNA的提取和PCR產物檢測

以玻璃珠法提取受試菌株基因組DNA,純度和濃度符合要求。PCR擴增產物中檢測到約1.5 kb左右DNA特異目標帶,純化后完成測序。

圖1 16株細菌基因組DNA電泳圖Fig.1 The electrophoresis figure ofgenome DNA extracted from 16 bacterial strains注:M-DL2000maker,1～16為16株不同的細菌菌株,圖2同。

圖2 16株細菌的16Sr DNA的PCR產物電泳圖Fig.2 The electrophoresis figure of16Sr DNA PCR amplification of 16 bacterial strains

2.3 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育學地位的確定

受試菌株中有34株獲得16S rDNA完整序列,與GenBank數(shù)據(jù)庫模式菌株比對分析,所有菌株堿基同源比率在98%～100%之間。用DNA分析軟件Clustalx(1. 8)進行多重序列比較[15],用MEGA4軟件中Neighbor-Joining方法完成分子系統(tǒng)學分析[16],同時進行1000次bootstrap統(tǒng)計學檢驗[17],構建系統(tǒng)發(fā)育樹展示細菌的遺傳多樣性和菌株間的親緣關系。系統(tǒng)發(fā)育樹展示菌株之間的親緣關系,其中13株鑒定到種,其余21株鑒定到屬,再結合形態(tài)特征確定了各細菌在微生物系統(tǒng)發(fā)育學上的地位(見圖3)。

由表3可見,3個生鮮乳樣中細菌種類數(shù)及其分布特點不同。其中1號樣至少有7種細菌,以Acinetobactersp.(不動桿菌屬)為主,2號樣至少有6種細菌,以Klebsiellasp.(克雷貝氏桿菌屬)為主,3號樣含有6種細菌且分布較為分散。通過對34株菌株的形態(tài)學觀察,這34株菌的形態(tài)均與《伯杰細菌鑒定手冊》第八版中的描述特征一致[12]。從致病性來看,分離菌株為條件致病菌或腐敗菌。奶樣中微生物種類特點是奶源地生境和奶牛健康狀況的反映。奶牛場中生鮮乳的細菌污染來源是多樣的。奶牛身體狀況、養(yǎng)殖場周邊環(huán)境衛(wèi)生狀況、采乳用具及操作細節(jié)等是防范牛乳污染的重要方面。

表3 3個采樣點細菌的分布特點

3 討論與結論

通過對實驗結果分析發(fā)現(xiàn),1號奶樣主要菌種為腸桿菌屬(Enterobactersp.)、不動桿菌屬(Acinetobactersp.),2號奶樣菌種主要為克雷白氏桿菌屬(Klebsiellasp.),3號采樣點的菌種分布不集中。奶牛廠中生鮮乳的細菌污染來源和差異性原因是多樣的。本本文涉及的3個采樣點屬于同一地區(qū)的不同養(yǎng)殖場,地理位置和氣候條件相近,不同之處在于奶牛飼養(yǎng)場小環(huán)境和衛(wèi)生管理水平。1號樣來自農戶,規(guī)模較小衛(wèi)生管理差,2和3號來自現(xiàn)代化標準奶牛場,小環(huán)境衛(wèi)生較好,擠奶操作規(guī)范。因此,各樣點細菌差異可能與奶場環(huán)境衛(wèi)生管理相關。

采用16S rDNA序列分析鑒定奶源細菌種類方法可分為培養(yǎng)法和免培養(yǎng)法。由于某些難養(yǎng)菌通過純培養(yǎng)不易培養(yǎng)成功,本文用培養(yǎng)方法很難全面反映生鮮乳中微生物的多樣性[18]。從理論上講,免培養(yǎng)法可以更真實反映奶樣中微生物的種類和群體數(shù)量。本研究曾采用免培養(yǎng)法多次直接從奶中提取宏基因組DNA,并PCR擴增獲得16S rDNA序列,構建生鮮乳中細菌微型16S rDNA基因文庫,至今未獲得理想效果。主要原因是:鮮奶中含有豐富蛋白質和油脂,DNA提取和PCR擴增難度增加;另外優(yōu)質奶源中微生物數(shù)量極少,不易獲得痕量宏基因組DNA;還有PCR產物與T載體連接效率低下,很少獲得重組子。腸桿菌屬(Enterobactersp.)、不動桿菌屬(Acinetobactersp.)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiellasp.)等屬內受試的各菌株間生理生化和毒力差異正在甄別中。對生鮮乳中細菌多樣性的研究,可有效防范肉毒梭菌等烈性致病菌及其毒素的危害,避免問題奶源進入加工工序,可從源頭控制奶的質量安全。

圖3 基于生鮮乳中34株細菌和相關菌株的16S rDNA序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of 34 bacterial strains from raw milk and related strains注:建樹采用臨位相連法并進行1000次bootstrap統(tǒng)計學檢驗。

表2 34株細菌16S rDNA序列及其相似模式菌株序列

本文比較分析了生鮮乳中細菌的多樣性,對生鮮乳的及時滅菌處理和低溫貯存提供了理論依據(jù),同時也為生鮮乳的后續(xù)加工工藝及其制品的安全評價提供了理論依據(jù)。

[1]李永平.不同條件下檢測生鮮乳中微生物總基因組DNA的比較[J].實用醫(yī)技雜志,2013,20(5):511-512.

[2]徐方旭,劉詩揚,蘭桃芳,等.食源性致病菌污染狀況及其應對策略[J].食品資源開發(fā),2014,35(1):98-101.

[3]郝惠云,王耀耀,朱研研,等.分子生物學技術在細菌分類鑒定中的研究進展[J].煤炭與化工,2014,4(37):40-42.

[4]張守文,尹蕾,周玉玲,等.乳品中有害微生物的檢測技術和發(fā)展方向[J].中國乳品工業(yè),2010,38(1):35-38.

[5]Clarridge JE 3rd. Impact of 16SrRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases[J].Clin Microbiol Rev,2004,17(4):840-862.

[6]Kolbert CP,Persing DH. Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens[J].Curr Opin Microbiol,1999,2(3):299-305.

[7]Woese C R,Fox G E,Zablen L,et al. Conservation of primary structure in 16S ribosomal RNA[J]. Nature,1975,254:83-86.

[8]Olsen GJ,Woese CR. Ribosomal RNA:a key to phylogeny[J]. FASEB J,1993,7:113-123.

[9]李引強,朱寶利,吳俊,等. 16S rRNA的分子生物學方法分析牛奶中的細菌菌群[J].食品科學,2013,34(20):255-260.

[10]宋金龍,林勇平,梁穎,等. 16S rDNA序列分析在臨床不常見細菌鑒定中的初步應用[J]. 熱帶醫(yī)學雜志,2014,14(5):611-614.

[11]Lucin A,Ilaria M,Roberto P,et al. Amplified ribosomal DNA restriction analysis for the characterization of Azotobacteraceae:a contribution to the study of these free-living nitrogen-fixing bacteria[J].J Microbiol Methods.2004,57(2):197-206.

[12]布坎南R E,吉本斯N E.伯杰氏細菌鑒定手冊[M].第8版.北京:科學出版社,1984:274-828.

[13]澳斯柏F,金斯頓RE,塞德曼JG,等.顏子穎,王海林譯.精編分子生物學實驗指南[M].北京:科學出版社,1998:99-103.

[14]王艷萍.應用16S rRNA基因序列分析技術鑒定臨床非典型細菌[D].重慶:重慶醫(yī)科大學,2013:8-10.

[15]Thompson JD,Gibson TJ,Plewniak F,et al. The Clustal-X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Res,1997,25(24):4876-4882.

[16]Saitou N,Nei M. The neighbor-joining method:A new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. MolBiol Evol,1987,4(4):406-425.

[17]Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies:an approach using the bootstrap[J]. Evolution,1985,39(4):783-791.

[18]Streit WR,Schmitz RA. Metagenomics-the key to the uncultured microbes[J]. Curr Opin Microbiol,2004,7:492-498.

Identification of bacterial species from raw milk by 16S rDNA sequencing

HAN Rui-fang,DONG Xiao-min,LIU Tian-ming*

(College of Food Science and Engineering of Qilu University of Technology,Shandong Province Key Laboratory of Microbial Engineering,Ji’nan 250353,China)

Using glass bead method to extract the genomic DNA of 34 bacterial strains which were isolated and purified in raw milk. Common primer 27f/1492r was used to amplify 16S rDNA fragments. The PCR products were sequenced. Then the 16S rRNA sequences were compared with GenBank database homologous sequence and the phylogenetic tree was constructed through clustering analysis. The phylogenetic status of 34 species of bacteria were determined combined with morphological and physiological characteristics. The results showed that 16 kinds of species were identified. Bacterial species and its distribution characteristics were different among three raw milk samples,where the 1st sample had 7 kinds of bacteria,mainlyAcinetobactersp;the 2nd sample had 6 species,mostlyKlebsiellasp.;the 3rd sample had 6 species of bacteria,the distribution was more dispersed. From the pathogenic point of view,all strains were opportunistic pathogens or spoilage,no virulent pathogens.

raw milk;16S rRNA;bacteria;identification

2014-10-23

韓瑞芳(1990-)，女，碩士，研究方向：食品生物技術,E-mail:HanRuifang1990@163.com。

*通訊作者:劉天明(1961-)，男，博士，教授，主要從事食品微生物技術方面的研究, E-mail:liutm2008@163.com。

國家科技支撐項目(2011BAC11B05)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0152-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.024