人工養(yǎng)殖大鯢皮體外消化及其膠原蛋白提取和功能性質(zhì)研究

袁 通,王錫昌,陳弘毅,王 蔚

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

人工養(yǎng)殖大鯢皮體外消化及其膠原蛋白提取和功能性質(zhì)研究

袁 通,王錫昌*,陳弘毅,王 蔚

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

通過體外消化法測定大鯢皮體外消化率;使用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面實驗,優(yōu)化大鯢皮膠原蛋白提取工藝;并對膠原蛋白凍干樣的功能性質(zhì)進行研究。結(jié)果表明:經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理的大鯢皮,其體外消化率高達96.66%;以加酶量、超聲時間和提取時間為三因素,膠原蛋白提取率為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化大鯢皮膠原蛋白提取率,其最優(yōu)化參數(shù)為加酶量1000 U/mL料液、提取時間33 h以及超聲時間12 min,此條件下最優(yōu)大鯢皮膠原蛋白提取率為71.94%,與模型預(yù)測值(73.32%)較一致;在20 ℃、相對濕度43%和81%條件下,大鯢皮膠原蛋白能長時間保留20%水分;大鯢皮膠原蛋白在0.4 g/100 mL濃度,溶液pH7以及溶液鹽離子濃度為1.25 mol/L時有最佳起泡性;當溶液pH4,鹽離子濃度為0.25 mol/L時鯢皮膠原蛋白有最佳乳化性。

大鯢，膠原蛋白,體外消化,響應(yīng)面,功能性質(zhì)

中國大鯢(Andriasdavidianus),俗稱娃娃魚,屬于兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科[1],是世界上現(xiàn)存兩棲類動物中最長壽的動物[2]。野生大鯢作為我國珍稀名貴特產(chǎn),已被列為國家二級保護動物[3]。大鯢具有較高的科研價值,也是一種傳統(tǒng)的名貴藥用動物,具有滋陰補腎、補血行氣的功效[4]。隨著大鯢養(yǎng)殖技術(shù)的提高,人工養(yǎng)殖大鯢的數(shù)量逐年上升,至2010年,全國大鯢養(yǎng)殖和繁殖數(shù)量已經(jīng)達到170多萬尾[5],資源量的增加使得大鯢能夠更好地成為食品與藥品的原料被開發(fā)利用。

膠原蛋白具有支撐器官和保護機體的功能,也是組成細胞間質(zhì)的最重要功能蛋白質(zhì)[6]。膠原蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)、來源、生物學(xué)意義及其在正常和病理組織中的分布情況等也逐漸被人們所認識[7]。膠原蛋白諸多的優(yōu)良性質(zhì),使其越來越多地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、高檔化妝品、生物肥料等工業(yè)領(lǐng)域[8]。水產(chǎn)膠原蛋白因其獨特的生理功能和理化特性而成為研究的熱點。大鯢皮中膠原蛋白含量非常豐富,其膠原蛋白可能具有一些陸生動物膠原蛋白所沒有的功能特性[9],本文從大鯢皮體外消化性質(zhì)進行研究;進而對大鯢皮膠原蛋白進行提取,并優(yōu)化提取工藝;之后以胃蛋白酶提取的大鯢皮膠原蛋白凍干品作為原料,進行膠原蛋白功能性質(zhì)的研究,旨在為將來大鯢資源開發(fā)利用,大鯢皮膠原蛋白應(yīng)用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6尾人工養(yǎng)殖大鯢于2011年 8月采自陜西省漢中市留壩縣養(yǎng)殖場,體長為(80.00±8.66)cm,體質(zhì)量為(3.57±0.09)kg,-80 ℃保存;胃蛋白酶(250 U/mg)、L-羥脯氨酸標準品 購自Sigma公司;胰蛋白酶(3000 U/g) 購自生工生物工程(上海)有限公司;魯花牌花生油 購自農(nóng)工商超市臨港店;其他試劑均為分析純。

UV2300紫外分光光度計 天美科學(xué)儀器;HPP108恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國美墨爾特;XS205電子天平、FE20pH計 梅特勒-托利多;T25高速分散機,T10basic分散機 IKA;AUY220天平Shimadzu;SW22振蕩水浴床 德國Julabo公司;J-26XP冷凍離心機 貝克曼庫爾特。

1.2 大鯢皮消化性質(zhì)分析方法

將解凍大鯢皮剪碎,以0.05 mol/L鹽酸作為消化液,液料比60∶1(v∶w),添加胃蛋白酶,37 ℃振蕩3 h;洗凈后用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至6.8,加胰蛋白酶在37 ℃下振蕩3 h,用凱氏定氮法測定殘留物中蛋白質(zhì)含量,并計算樣品蛋白質(zhì)消化率[10]。

1.3 大鯢膠原蛋白提取純化方法

1.3.1 提取鯢皮膠原蛋白的原料皮經(jīng)過解凍剪碎,用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡1 d去除非膠原蛋白,期間更換1次浸泡液,去離子水洗凈;用10%異丙醇浸泡1d去除脂質(zhì),期間更換1次浸泡液,去離子水洗凈;加入含胃蛋白酶的0.5 mol/L醋酸溶液,液料比為20∶1(v∶w),在15 ℃條件下進行提取[11]。并參照國標GB/T 9695.23-2008進行羥脯氨酸含量測定。酶解液中膠原蛋白得率(W,%)和提取率(X,%)換算公式如下公式所示:

式中:ω為酶解液中羥脯氨酸的質(zhì)量;11.1為羥脯氨酸換算系數(shù)。

1.3.2 鯢皮膠原蛋白的純化 將提取液用紗布粗濾,濾液經(jīng)過14000 r/min離心35 min,上清液添加含0.5 mol/L醋酸的氯化鈉溶液直到溶液鹽離子濃度為0.9 mol/L,攪拌后靜置12 h,溶液經(jīng)過6000 r/min離心25 min,取沉淀用0.5 mol/L醋酸溶液溶解12 h,溶液再經(jīng)過14000 r/min離心35 min,取上清液用14 ku的透析袋進行透析直到無氯離子檢出,樣品溶液進行冷凍干燥,得到凍干樣(PSC)待用[8]。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化膠原蛋白提取工藝

1.4.1 單因素實驗 以加酶量:200、400、600、800、1000 U/mL料液;提取時間:12、18、24、30、36 h;超聲時間:0、10、20、30、40 min為單因素條件分別進行實驗,其超聲頻率為40 kHz,超聲功率為300 W。并通過羥脯氨酸標準曲線換算膠原蛋白提取率。

1.4.2 因素設(shè)計與編碼水平

表1 三因素實驗設(shè)計方案

1.5 大鯢膠原蛋白吸濕性分析

以43%和81%為實驗相對濕度,20 ℃為實驗環(huán)境溫度,精確稱量0.5 g凍干試樣PSC及甘油(對照樣)平鋪于40 cm×25 mm的稱量瓶中,放置于設(shè)置好相對濕度和溫度的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中,每隔6 h進行一次稱量,直至稱量瓶恒重,則樣品吸濕性按公式[12-13]進行計算:

式中:W0為試樣初始質(zhì)量(g);Wn為試樣第n小時后的質(zhì)量(g)

1.6 大鯢膠原蛋白保濕性分析

以43%和81%為實驗相對濕度,20 ℃為實驗環(huán)境溫度,精確稱量PSC配制0.2%樣品溶液以及5%甘油溶液(對照樣),平鋪于40 mm×25 mm的稱量瓶中,并放置于設(shè)置好相對濕度和溫度的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中,每隔3 h進行一次稱量,直至稱量瓶恒重,則樣品保濕性按公式[14-15]進行計算:

式中:W0為稱取樣品的質(zhì)量(g);W1為試樣和稱量瓶的初始質(zhì)量(g);Wn為試樣和稱量瓶第n小時的質(zhì)量(g)。

1.7 大鯢膠原蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性分析

配制蛋白溶液,置于高速剪切機中,以12000 r/min剪切1 min,記錄停止時泡沫體積,并記錄10 min后泡沫體積。取不同蛋白濃度于0.5 mol/L醋酸溶液中進行實驗,在0.4%蛋白濃度下,取不同pH溶液進行實驗;在pH7,0.4%蛋白濃度時取不同溶液鹽離子(NaCl)濃度進行實驗。起泡性(FA)和泡沫穩(wěn)定性(FS)計算公式[16]如下:

公式中:V0為起始溶液體積;V1為1 min剪切后泡沫體積;V10為靜置10 min后泡沫體積

1.8 大鯢膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性分析

精確稱量凍干樣品,配制0.2%(g/L)蛋白溶液。取12 mL蛋白溶液與4 mL花生油混合,用分散機在12000 r/min條件下分散1 min,迅速從底部量取50 μL溶液與5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的SDS溶液混合,用紫外分光光度計在500 nm處測定其吸光值(以0.1%SDS溶液為空白),混合液靜置10 min再次進行吸光值測定。分別在不同pH條件下進行實驗;并在pH=8時取不同離子濃度(NaCl)進行實驗。乳化性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)計算公式[17]如下:

式中:C為樣品濃度,g/L;Φ為乳化液中油相的比例,0.25;L為比色皿光徑,1 cm;N為稀釋倍數(shù);A0為乳化液1 min的吸光值;A10為乳化液10 min后的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢皮體外消化結(jié)果分析

大鯢皮體外消化率如圖1、圖2所示:

圖1 不同胃蛋白酶添加量對大鯢皮消化率的影響Fig.1 The digestibility of skin by different pepsin amount

圖2 不同胰蛋白酶添加量對大鯢皮消化率的影響Fig.2 The digestibility of skin by different trypsin amount

由圖1可知,當酶含量達到1400 U/g料液時,大鯢皮體外消化率達到較高值為79.57%,其后胃蛋白酶量的增加對消化率提升不大,可能因為大部分蛋白已經(jīng)酶解消化,所以選取1400 U/g料液作為最適胃蛋白酶添加量;由圖2可知,經(jīng)過胰蛋白酶酶解處理的人工養(yǎng)殖大鯢鯢皮其體外消化率并沒有隨著消化液中胰蛋白酶含量的增加而增加,基本呈現(xiàn)一個平穩(wěn)的狀態(tài),說明消化液中超過500 U/g料液添加量之后其胰蛋白酶的含量對大鯢鯢皮的體外消化率并沒有顯著的影響。所以取胰蛋白酶添加量為600 U/g料液作為最優(yōu)添加量。

如表2所示,經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合作用對人工養(yǎng)殖大鯢鯢皮體外消化率為96.66%。

表2 大鯢皮體外消化率

2.2 單因素實驗結(jié)果分析

由圖3a可知,隨著超聲時間的增加鯢皮膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;由于大鯢皮皮質(zhì)較厚結(jié)構(gòu)緊密,所以經(jīng)過10 min超聲能夠使得大鯢皮提取率有顯著提升;由圖3b可知,胃蛋白酶含量在200 U/mL到800 U/mL之間,隨著胃蛋白酶含量的上升,提取率呈上升趨勢。由圖3c可知,大鯢皮膠原蛋白提取率在12 h到30 h之間隨著時間的增加呈上升趨勢,隨時間的增加,膠原蛋白濃度提升,酶解液粘度不斷增加,胃蛋白酶與原料之間的接觸逐漸減少,而當提取時間超過30 h,提取率沒有顯著變化。

圖3 超聲時間、加酶量和提取時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time, enzyme amountand extraction time on extraction of collagen

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.3.1 實驗結(jié)果及回歸方程 實驗設(shè)計方案結(jié)果如表3。

表3 實驗設(shè)計方案及其結(jié)果

采用Design expert8軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化分析,得到提取率Y對超聲時間X1、加酶量X2和提取時間X3的二次回歸模型:

Y=70.69+0.71X1+3.71X2+1.81X3+2.16X1X2+1.08X1X3+0.19X2X3-8.60X12-1.92X22-1.99X32

對上述回歸模型進行回歸系數(shù)和方差分析的顯著性實驗,結(jié)果如表4所示。

由表4可以得出模型的p為0.0099<0.01,表明模型為極顯著;失擬項為0.0695>0.05,說明模型失擬不顯著,與實際擬合較好。方程R2為89.67%,該回歸模型能表述響應(yīng)值的變化,因此該模型能夠?qū)Υ篥F皮膠原蛋白提取率進行分析和預(yù)測。根據(jù)回歸模型X1、X2、X3的系數(shù)估計值 分別為0.71、3.71和1.81可知,各因素對大鯢皮膠原蛋白提取率影響大小順序依次為:X2>X3>X1,即加酶量>提取時間>超聲時間。

表4 回歸參數(shù)方差分析

2.3.2 最優(yōu)工藝參數(shù)和驗證實驗 采用Design-Expert軟件進行大鯢膠原蛋白提取率優(yōu)化,最終得到模型最優(yōu)化參數(shù)為加酶量1000 U/mL溶液、提取時間33.32 h、超聲時間12.02 min,此時大鯢皮膠原蛋白模型預(yù)測提取率為73.32%。為了驗證模型方程的可行性,同時兼顧實際操作的便利性,調(diào)整上述模型參數(shù)為加酶量1000 U/mL溶液、提取時間33h、超聲時間12 min,重復(fù)3次進行驗證實驗,最后得到大鯢膠原蛋白平均提取率為71.94%,與模型預(yù)測值73.32%僅偏差1.38%,說明相應(yīng)面法建立的模型能真實地描述工藝中各個參數(shù),此模型能較好地利用于優(yōu)化大鯢皮膠原蛋白提取工藝。

2.4 鯢皮膠原蛋白吸濕性結(jié)果分析

鯢皮膠原蛋白在相對濕度43%和81%時吸濕性結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 相對濕度為43%時的吸濕性Fig.4 The Moisture absorption in 43% relative humidity

圖5 相對濕度為81%時的吸濕性Fig.5 The Moisture absorption in 81% relative humidity

如圖4可知,在相對濕度為43%時,大鯢PSC吸濕性達到10%左右;圖5為相對濕度為81%時,大鯢PSC吸濕性達到20%左右;大鯢PSC吸濕性低于甘油吸濕性,這是因為甘油分子上含有三個羥基,其分子相對親水基團比例較高,所以有較好的吸濕性,而大鯢PSC是三螺旋結(jié)構(gòu),其暴露外部的親水基團比例相對較少,所以吸濕能力要低于甘油。

2.5 鯢皮膠原蛋白保濕性結(jié)果分析

鯢皮膠原蛋白在相對濕度43%和81%時失水率結(jié)果如圖6、圖7所示。

圖6 相對濕度為43%時的失水率Fig.6 The water lose rate in 43% relative humidity

圖7 相對濕度為81%時的失水率Fig.7 The water lose rate in 81% relative humidity

由圖6可知,隨著時間的增加,大鯢PSC和甘油的保水性要明顯優(yōu)于水對照組,同時得出大鯢PSC保水性要優(yōu)于甘油組,但差異不顯著。由圖7可知,隨著環(huán)境中相對濕度的增加,大鯢PSC保濕性增強。由于膠原蛋白分子相對于甘油分子含有更多親水基團,水溶液中膠原蛋白與水分子能形成更緊密的結(jié)構(gòu),所以大鯢PSC具有較好地保濕性,能較長時間保留20%的水分。

2.6 鯢皮膠原蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性結(jié)果分析

2.6.1 蛋白含量對鯢皮膠原蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響 由圖8可知,大鯢PSC起泡性要優(yōu)于相同濃度下明膠溶液。并且在蛋白濃度為0.4%時大鯢PSC有最優(yōu)起泡性為200%。由圖9可知,大鯢PSC雖然有較好起泡性但是其泡沫穩(wěn)定性較差,在蛋白濃度越低時其泡沫穩(wěn)定性越差,在0.4%蛋白濃度時有最優(yōu)泡沫穩(wěn)定性為20%。

圖8 蛋白濃度對溶液起泡性的作用Fig.8 The effect of protein concentration on foaming ability

圖9 蛋白濃度對溶液泡沫穩(wěn)定性的作用Fig.9 The effect of protein concentration on foam stability

2.6.2 溶液pH對鯢皮膠原蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響 由圖10可知,大鯢PSC在pH7時有最優(yōu)起泡性150%,隨著pH上升,起泡性上升,但在pH5時有一個明顯下降點,這是因為在pH5時大鯢PSC處在其等電點附近,導(dǎo)致蛋白溶液穩(wěn)定性下降,從而使得蛋白溶液起泡性降低。相比于明膠,在較低pH(低于4)時大鯢PSC起泡性要低于明膠起泡性,而當pH>4時大鯢PSC起泡性明顯高于明膠起泡性。但是從圖11可以得出明膠泡沫穩(wěn)定性要明顯優(yōu)于大鯢PSC。

圖10 pH對溶液起泡性的作用Fig.10 The effect of pH on foaming ability

圖11 pH對溶液泡沫穩(wěn)定性的作用Fig.11 The effect of pH on foam stability

2.6.3 溶液鹽離子含量對鯢皮膠原蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響 由圖12可知,氯化鈉濃度小于0.5 mol/L時大鯢PSC起泡性要低于明膠溶液,但當氧化鈉濃度大于0.5 mol/L時,大鯢PSC起泡性要高于明膠溶液,而當氯化鈉濃度在1.25 mol/L時,大鯢PSC有最優(yōu)起泡性為180%。由圖13可知,大鯢PSC在不同離子濃度下泡沫穩(wěn)定性都要低于明膠,并且在離子濃度為0.5、0.75 mol/L時最為顯著。

圖12 離子濃度對溶液起泡性的作用Fig.12 The effect of ion concentration value on foaming ability

圖13 離子濃度對溶液泡沫穩(wěn)定性的作用Fig.13 The effect of ion concentration on foam stability

2.7 鯢皮膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性結(jié)果分析

2.7.1 溶液pH對鯢皮膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響 由圖14可知,大鯢PSC在pH2時乳化性基本與明膠持平,當pH大于2而小于8時,明膠的乳化性要優(yōu)于大鯢PSC,當pH>8時,大鯢PSC乳化性則優(yōu)于明膠;而pH6附近大鯢PSC處在其等電點,其乳化性出現(xiàn)了最低點0.45 m2/g。由圖15可知,大鯢PSC在pH2時有較高的乳化穩(wěn)定性,但隨著pH升高乳化穩(wěn)定性迅速降低,而在pH≥6時,大鯢PSC乳化穩(wěn)定性基本與明膠持平。

圖14 pH對溶液乳化性的作用Fig.14 The effect of pH on emulsifying activity

圖15 pH對溶液乳化穩(wěn)定性的作用Fig.15 The effect of pH on emulsion stability

2.7.2 溶液鹽離子濃度對鯢皮膠原蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響 由圖16可知,當離子濃度為0.25 mol/L時大鯢PSC有最優(yōu)乳化性為0.7 m2/g;在有離子存在的情況下,明膠乳化性要明顯優(yōu)于大鯢PSC。由圖17可知,在有離子存在的情況下大鯢PSC乳化穩(wěn)定性隨著離子濃度的上升而呈下降趨勢,并且皆低于明膠的乳化穩(wěn)定性。

圖16 離子濃度對溶液乳化性的作用Fig.16 The effect of ion concentration on emulsifying activity

圖17 離子濃度對溶液乳化穩(wěn)定性的作用Fig.17 The effect of ion concentration on emulsion stability

3 結(jié)論

本研究通過模擬人體腸胃消化建立體外消化模型,胃蛋白酶最適量為1400 U/g料液,胰蛋白酶最適量為600 U/g,最終得到大鯢皮體外消化率為96.66%。此研究值比路紅波,劉俊榮等[18]研究的大比目魚(88%)、鮭魚(85%)、鰱魚(85%)魚肉蛋白的消化率高。說明大鯢皮更易于人體的消化吸收。

本研究通過響應(yīng)面實驗優(yōu)化提取工藝,實驗表明各因素對工藝影響大小依次為:加酶量>酶解時間>超聲時間;最優(yōu)化參數(shù)為加酶量1000 U/mL料液、提取時間33 h以及超聲時間12 min,在此條件下有最優(yōu)大鯢皮膠原蛋白提取率和得率分別為71.94%和15.42%。此結(jié)果低于王忠穩(wěn)等人草魚皮膠原蛋白得率(19.8%),高于楚水晶等[19]和Sitthipong Nalinanon等[20]研究的馬面魚和大眼鯛魚皮膠原蛋白得率(分別為9.66%和9.86%)。

通過對大鯢皮膠原蛋白凍干品進行功能性質(zhì)研究,得出大鯢膠原蛋白能長時間保留至少20%水分;在蛋白濃度為0.4%時有最優(yōu)起泡性為200%,在pH為7時有最優(yōu)起泡性為150%,在離子濃度為1.25%時有最優(yōu)起泡性180%;乳化性結(jié)果顯示:pH在4時有較好乳化性為1.1 m2/g;在離子濃度為0.25 mol/L時有較好乳化性為0.7 m2/g。

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Study on the extraction and functional properties of collagens from the skin of Chinese giant salamander and its digestibilityinvitro

YUAN Tong,WANG Xi-chang*,CHEN Hong-yi,WANG Wei

(College of Food Science and Technology,Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Theinvitrodigestion of the Chinese giant salamander skin was evaluated. The Box-Behnken design response surface test was used to optimize the extraction process of the collagen of the Chinese giant salamander skin. The functional properties of the collagen were also studied. The results showed that:theinvitrodigestion of the Chinese giant salamander skin had reached 96.66%. The optimal condition for the extraction were the combination of adding 1000 U/mL of enzyme,33 h of extraction and 12 min of ultrasonic. The yield reached 71.94%,similar with the model predicted value(73.32%). Under the condition of 20 ℃ and 43% and 81% RH,20% of water could be hold for a long time. The pepsin soluble collagen(PSC)had the best foaming ability when the protein concentration was 0.4 g/100 mL,pH7 and the salt ion concentration was 1.25 mol/L. When pH was 4,salt ion concentration was 0.25 mol/L,the salamander skin collagen had the best emulsibility.

salamander;collagen;invitrodigestibility;response surface;functional properties

2014-11-13

袁通(1989-),男,碩士,研究方向:食品營養(yǎng)與風(fēng)味,E-mail:chotmat@163.com。

*通訊作者:王錫昌(1963-),男，博士，教授,研究方向:食品營養(yǎng)與安全，E-mail:xcwang@shou.edu.cn。

上海市科委工程中心建設(shè)項目(11DZ2280300);上海市教委重點學(xué)科建設(shè)項目(J50704)。

TS254.4

A

1002-0306(2015)15-0130-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.020