三斑海馬蛋白肽ACE抑制活性的研究

徐克寒,申鉉日,*,陳國華

(1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228;2.海南大學(xué)海洋學(xué)院,海南海口 570228)

三斑海馬蛋白肽ACE抑制活性的研究

徐克寒1,申鉉日1,*,陳國華2

(1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228;2.海南大學(xué)海洋學(xué)院,海南?？?570228)

本文通過三斑海馬酶解液的制備、ACE抑制活性肽的分離和體外消化模型的建立研究了三斑海馬蛋白肽的ACE抑制活性。利用堿性蛋白酶制備得到具有ACE抑制活性的三斑海馬酶解液,經(jīng)葡聚糖凝膠層析分離純化后,得到具有較高ACE抑制活性的組分(其IC50為0.91 mg/mL);通過對該組分的氨基酸組成和體外消化模型分析,發(fā)現(xiàn)該組分中疏水性氨基酸的含量為50.48%,消化酶作用后,顯著提高ACE抑制活性,經(jīng)判斷,該組分中的蛋白肽為前體型抑制劑。

三斑海馬,ACE抑制,酶解液

海馬(Hippocampus)隸屬于海龍科,是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,性溫、味甘咸,具有溫腎壯陽、散結(jié)消腫的功效,可用于治療陽痿、遺尿、腎虛作喘、癥瘕積聚、跌撲損傷及癰腫疔瘡[1]。近年來,國內(nèi)外研究表明,海馬活性成分豐富,含有甾體類、蛋白質(zhì)、脂肪酸類、磷脂類等,其中蛋白質(zhì)含量高達(dá)67.90%～73.56%(干重),并具有溫腎壯陽、抗疲勞、延緩衰老、抗腫瘤、抗炎等活性[2-3],應(yīng)用前景廣泛。目前,過度捕撈導(dǎo)致海馬瀕危,迫切需要更多地了解其獨特的生物生理學(xué)和藥理學(xué)特性,以合理利用這一珍貴物種[4]。

高血壓已成為世界第一殺手,高血壓患者也逐漸出現(xiàn)年輕化,安全、有效地治療高血壓迫在眉睫。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-I converting enzyme,ACE)為二肽羧基蛋白酶,是人體調(diào)節(jié)血壓過程中尤為重要的一種蛋白酶。在人體腎素-血管緊張素系統(tǒng)中,ACE將不具有生理活性的血管緊張素-Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素-Ⅱ,促使血管收縮、醛固醇分泌以及Na和水的保留,從而升高血壓[5];另外,在人體胰舒血管素-激肽系統(tǒng)中,ACE降解舒緩激肽,使其喪失舒張血管的功能,從而升高血壓[6]。因此,若能有效的抑制ACE活性,將有利于降低人體血壓。目前,已從多種不同的動物及植物體內(nèi)分離得到ACE抑制肽[7],如三文魚、金槍魚、海藻、大豆、奶制品等,但是關(guān)于海馬ACE抑制活性的研究尚未見報道。

因此,本研究以三斑海馬為原料,采用蛋白酶酶解法,并利用葡聚糖凝膠層析進(jìn)行初步分離,獲得具有較高ACE抑制活性的組分,并對該組分進(jìn)行氨基酸組成分析及體外消化實驗,為進(jìn)一步海馬活性研究提供依據(jù)及參考,以期提高海馬的利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三斑海馬干品 廣州市天澤貿(mào)易有限公司;胰蛋白酶(250 U/mg)、堿性蛋白酶(2000 U/mg)、木瓜蛋白酶(6000 U/mg)、胃蛋白酶(2100 U/mg) 南寧龐博有限公司;ACE、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)、豬胃蛋白酶(806.3 U/mg protein)、牛胰凝乳蛋白酶(40 U/mg protein)、牛胰蛋白酶(12132 U/mg protein) 美國SIGMA公司;Sephadex G-25 北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純或色譜純。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;HL-2恒流泵 南京普陽科學(xué)儀器研究所;HD-5電腦紫外檢測儀南京大學(xué);PHS-3C精密pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;TDL-60B低速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;FD5512冷凍干燥機(jī) 韓國ilShin;電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Agilent1100高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三斑海馬酶解液的制備 將三斑海馬干品粉碎,稱取一定質(zhì)量三斑海馬粉末置于燒杯中。選擇堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶四種酶,酶解條件為料液比1∶15(g∶mL)、加酶量1.0%(酶/底物蛋白質(zhì),w/w),并按表1的酶解pH和溫度下酶解6 h。100 ℃滅酶10 min后,抽濾,收集濾液,并進(jìn)行離心,取上清液,獲得三斑海馬酶解液,適當(dāng)濃縮后冷凍干燥,制得三斑海馬酶解液凍干粉,隔光隔氧保存。

表1 四種蛋白酶的酶解條件[8]

1.2.2 ACE抑制率的測定 采用Liu[8]的方法測定ACE抑制率。取30 μL試樣、250 μL 5 mmol/L底物HHL溶液(溶于含0.6 mol/L NaCl的硼酸緩沖液,pH 8.3)置于螺口試管中,混勻,于37 ℃水浴5 min后,向螺口試管中加入0.06 U/L ACE溶液(溶于硼酸緩沖液,pH 8.3),混勻,于37 ℃水浴60 min后,加入1 mol/L HCl終止反應(yīng),充分混勻后,加入1.5 mL乙酸乙酯萃取反應(yīng)生成的馬尿酸,離心3000 r/min、10 min,移取1 mL上層溶液置于磨口試管中,真空濃縮干燥蒸干乙酸乙酯后,加3 mL蒸餾水置于試管中復(fù)溶馬尿酸,于228 nm波長處測定吸光度值。ACE抑制率按下列公式計算:

其中,ES-試樣組的吸光度值;EC-空白組的吸光度值;EB-加入ACE之前提前加入HCl組的吸光度值。

1.2.3 ACE抑制肽的分離純化 選擇Sephadex G-25凝膠用于分離。凝膠預(yù)處理后,填裝至2 cm×100 cm的層析柱中,平衡3～4 h,流速調(diào)節(jié)至1 mL/min,上樣(試樣溶于蒸餾水,溶度為25 mg/mL,上樣量為2 mL),以蒸餾水為洗脫液進(jìn)行洗脫。檢測波長為280 nm,按峰進(jìn)行收集,多次收集后,將收集液濃縮并冷凍干燥,適當(dāng)條件下保存。

1.2.4 氨基酸組成分析 對經(jīng)過Sephadex G-25層析分離得到ACE抑制活性最高的組分進(jìn)行氨基酸含量分析,按照GB/T22492-2008進(jìn)行檢測。

1.2.5 體外消化實驗 采用陳飛平[9]的實驗方法,并稍作改進(jìn)。將經(jīng)過Sephadex G-25層析分離得到ACE抑制活性最高的組分用蒸餾水配成濃度為2 mg/mL的溶液,用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH2,加入1%(w/v)胃蛋白酶,于37 ℃振蕩保溫2 h,在100 ℃下滅酶5 min,冷卻至室溫后,5000 r/min離心20 min,取1 mL上清液用于測定ACE抑制率,剩余上清液用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH8.3,加入2%(w/v)胰凝乳蛋白酶,于37 ℃振蕩保溫2.5 h,在100 ℃下滅酶5 min,冷卻至室溫后,5000 r/min離心20 min,取1 mL上清液用于測定ACE抑制率,剩余上清液用胰蛋白酶處理,方法同胰凝乳蛋白酶處理方法,完成后取上清液用于測定ACE抑制率。

1.3 統(tǒng)計分析

采用originPro 8軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,兩組間的數(shù)據(jù)比較采用T-檢驗,p<0.05表示差異有顯著意義,p<0.01表示差異有極顯著意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 三斑海馬酶解液ACE抑制肽的制備

蛋白酶的選擇對制備活性多肽尤為重要,它的酶切位點會影響多肽的骨架,使酶解液呈現(xiàn)出強(qiáng)弱不同的ACE抑制活性。本研究選取了四種商業(yè)用酶,為堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶,分別對三斑海馬進(jìn)行酶解,探討其酶解液的ACE抑制活性。分別稱取一定質(zhì)量的四種酶解物凍干粉,配置成濃度為1 mg/mL的溶液,測定酶解液的ACE抑制率,實驗結(jié)果見圖1。結(jié)果表明,四種酶解液都表現(xiàn)出一定的ACE抑制活性,其中堿性蛋白酶酶解液(SHP)的ACE抑制率最高,為37.75%。通常情況下,ACE抑制肽為短肽,并含有疏水性氨基酸殘基[10],而堿性蛋白酶是一種絲氨酸型的內(nèi)切酶,傾向于形成以疏水性氨基酸為末端的肽[11],并且,堿性蛋白酶能切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鏈-CO-NH-生成分子量較小的多肽。因此,選擇堿性蛋白酶酶解液做進(jìn)一步的分離純化。

圖1 不同酶解液的ACE抑制率Fig.1 ACE-inhibitory activityof the different three-spot hippocampus hydrolysates

2.2 三斑海馬ACE抑制肽的分離純化

ACE抑制肽的理化性質(zhì)和生物活性主要取決于其分子量大小及氨基酸序列[12]。葡聚糖凝膠層析是依據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù),分子量大的物質(zhì)先出峰,分子量小的物質(zhì)后出峰。選取Sephadex G-25對SHP進(jìn)行分離,獲得分子量大小不同的組分。用蒸餾水以1 min/mL的流速進(jìn)行洗脫,得到如圖2的層析譜圖。由圖2可知,SHP通過Sephadex G-25凝膠分離得到6個峰,分別為SHP1、SHP2、SHP3、SHP4、SHP5和SHP6。

圖2 SHP(A)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白(B)的葡聚糖凝膠層析譜圖Fig.2 Gel filtration chromatography of SHP(A)andprotein marker(B)on a Sephadex G-25 column

按峰收集,分別測定濃度為1 mg/mL收集液的ACE抑制率。從圖3顯示的結(jié)果可知,組分SHP5的ACE抑制率最高,為57.45%,IC50為0.91 mg/mL。經(jīng)Sephadex G-25凝膠分離的SHP5與SHP相比,ACE抑制率明顯提高。將SHP葡聚糖凝膠層析譜圖與標(biāo)準(zhǔn)蛋白譜圖進(jìn)行對比,可以判斷SHP5的分子量小于1000 u,與大多ACE抑制肽的分子量小于1500 u[13]的研究成果相符。

圖3 SHP葡聚糖凝膠分離各組分的ACE抑制率Fig.3 ACE-inhibitory activity of thefractions on gel filtration chromatography

2.3 氨基酸組成分析

ACE抑制肽通常含有疏水性氨基酸殘基,并且ACE抑制肽C端的三個氨基酸序列會影響多肽與結(jié)合ACE的能力,若該位置含有疏水性氨基酸,則該肽極有可能具有較高的ACE抑制活性[14];也有研究者發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽C端氨基酸為芳香族氨基酸或脯氨酸,或N端為疏水性氨基酸(除脯氨酸)時,ACE抑制肽活性較強(qiáng)[15]。從表2可知,SHP5的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸分別占總氨基酸含量的50.48%、7.78%,與A. Alemán[16]從烏賊皮膠原蛋白分離得到ACE抑制活性最高的組分(分子量小于1000 u)的疏水性氨基酸含量為54.6%的結(jié)果近似。組分SHP5中丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸和纈氨酸的含量較高。目前,諸多研究發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽中含有丙氨酸、谷氨酸和甘氨酸,如海蜇(IGDEPLANYL)[17]、海參(MEGAQEAQGD)[18]及海蝦(IFVPAF)[19]等。但氨基酸序列對ACE抑制活性的影響較大,需要更深入的研究。

表2 SHP5的氨基酸組成分析

2.4 體外消化實驗

體外消化實驗是通過模擬人體胃腸道消化,考察物質(zhì)能否抗消化酶的消化。對SHP5進(jìn)行體外消化模擬實驗,依次采用胃蛋白酶(P)、胰凝乳蛋白酶(C)和胰蛋白酶(T)酶解,每步測定消化液的ACE抑制率。從圖4可知,在體外消化模擬實驗中,SHP5經(jīng)胃蛋白酶消化后,ACE抑制率顯著提高,從55.48%提高至76.65%;再經(jīng)胰凝乳蛋白酶消化后,ACE抑制率再次提高,提高至93.75%;最后經(jīng)胰蛋白酶消化后,ACE抑制率基本不變,為93.24%。實驗結(jié)果表明,該組分經(jīng)消化后ACE抑制活性顯著提高,抑制率提高了37.76%,表明SHP5為前體型抑制劑,口服后在人體內(nèi)具有降低血壓的活性。

圖4 SHP5消化酶處理后的ACE抑制率Fig.4 ACE-inhibitory activity ofcomponent SHP5 treated by digestive enzyme注:與SHP5相比較,**表示差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論

本研究對三斑海馬的降血壓活性進(jìn)行探討,發(fā)現(xiàn)三斑海馬堿性蛋白酶酶解液具有較高的ACE抑制活性。該酶解液經(jīng)葡聚糖凝膠層析分離后,分離組分SHP5(分子量<1 ku)的ACE抑制率最高,IC50為0.91 mg/mL。實驗結(jié)果還表明,該分離組分中疏水性氨基酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和亮氨酸含量較高,且其經(jīng)消化酶作用后ACE抑制活性顯著提高。今后,有待于對該分離組分的消化液進(jìn)行深入的分析研究。

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Angiotensin I-converting enzyme(ACE)inhibitory activity of enzymatic hydrolysate from three-spothippocampus

XU Ke-han1,SHEN Xuan-ri1,*,CHEN Guo-hua2

(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China;2.College of Ocean,Hainan University,Haikou 570228,China)

In this paper,the ACE-inhibitory activity of three-spothippocampuspeptides were evaluated by studying the preparation technique of three-spothippocampusenzymatic hydrolysate,screening chromatography separation of ACE-inhibitory peptides and establishing the model. The enzymatic hydrolysate with ACE-inhibitory activity was prepared by alkaline protease,and then separated and purified by gel filtration chromatography. After determination,the lower molecular fraction exerted the highest ACE-inhibitory activity(IC50was 0.91 mg/mL). The composition of amino acids in it was analyzed,and the test result indicated that the content of hydrophobic amino acids was 50.48%. In addition,it was suggested that the ACE-inhibitory peptides acted as ‘prodrug-type’ inhibitor after establishing the model of artificial gastrointestinal digestion. ACE-inhibitory activity was increased significantly under condition of digestive enzyme digestion.

three-spothippocampus;ACE-inhibitory activity;hydrolysate

2014-11-05

徐克寒(1990-),女,碩士研究生,研究方向：水產(chǎn)品加工,E-mail:793874992@qq.com。

*通訊作者:申鉉日(1968-),男,博士,教授,研究方向：海洋生物資源利用、食品科學(xué),E-mail:shenxuanri2009@163.com。

十二五國家科技支撐計劃課題(2013BAB01B04)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)15-0096-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.012