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    一個中國G6PD缺乏癥家系致病基因的突變分析

    2015-07-31 22:28:40林美華陳業(yè)達(dá)歐陽平譚藝青趙小蕾覃繼恒饒紹奇
    關(guān)鍵詞:基因突變研究

    林美華,陳業(yè)達(dá),歐陽平,趙 翔,譚藝青,趙小蕾,覃繼恒,饒紹奇

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    研究論文

    一個中國G6PD缺乏癥家系致病基因的突變分析

    林美華#,陳業(yè)達(dá)#,歐陽平,趙 翔,譚藝青,趙小蕾,覃繼恒,饒紹奇*

    (廣東醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究所與公共衛(wèi)生學(xué)院, 廣東 東莞 523808)

    目的對一個葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥家系成員G6PD基因13個外顯子全面測序,識別致病的突變位點及其遺傳模式。方法在G6PD缺乏癥高發(fā)區(qū)廣東惠州地區(qū)收集到一個G6PD缺乏癥核心家系,包括先證者(兒子)、患病母親和正常父親。取家系成員的外周血樣,并提取基因組DNA,用PCR和DNA測序法對G6PD基因全部外顯子進(jìn)行序列分析。結(jié)果先證者及其母親在G6PD基因第2號外顯子出現(xiàn)同一點突變(c.95A>G,p.His32Arg),該突變引起組氨酸被精氨酸替換(CAC>CGC)。然而先證者父親在G6PD基因的13個外顯子均未出現(xiàn)突變。3種生物信息學(xué)軟件均預(yù)測該突變對蛋白質(zhì)功能具有較強(qiáng)的危害性。結(jié)論該家系中c.95A>G呈X連鎖顯性遺傳,是G6PD缺乏癥的致病突變位點之一。

    葡萄糖-6-磷酸脫氫酶;基因突變;外顯子測序

    葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)缺乏癥為一種常見的伴性不完全顯性遺傳病,常見于中國西南和華南地區(qū),其受累人數(shù)多[1]。G6PD對細(xì)胞內(nèi)自由基和H2O2的清除起著重要的作用[2],其基因突變導(dǎo)致的缺陷會引起紅細(xì)胞膜的損害,導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。有研究報道G6PD缺陷癥的患者中有多種突變基因型[3],然而,像這些關(guān)于G6PD基因突變位點的研究多數(shù)是基于群體的篩查,鮮有基于家系的遺傳分析。本研究利用在廣東惠州地區(qū)收集到一個G6PD缺乏癥核心家系,通過對該家系成員的G6PD基因13個外顯子全面測序,識別出致病的突變位點為c.95A>G,呈X連鎖顯性遺傳。該結(jié)果將有助于華南地區(qū)G6PD缺乏癥的基因診斷和產(chǎn)前咨詢。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象

    本實驗室研究人員在廣東省惠州市人民醫(yī)院收集一個家系共3人,兒子(先證者)及其母親確診為G6PD缺乏癥,其父親為正常個體。研究人員采集此家系人員的血液樣本,同時調(diào)查了該家系成員的臨床信息,采血和調(diào)查之前均獲得家庭成員的知情同意。

    1.2 主要試劑

    DNA提取試劑盒(Tiangen公司);PCR試劑盒(TaKaRa公司);核酸電泳DNA marker(北京索萊寶科技有限公司)。

    1.3 全血基因組DNA的提取

    抽取G6PD缺乏癥患者4 mL外周血,用DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA,嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

    1.4G6PD基因的擴(kuò)增

    9對上下游引物涵蓋了X染色體上G6PD基因的13個外顯子,其中用第3對引物擴(kuò)增第3、4號外顯子,用第8對引物擴(kuò)增第10、11號外顯子,用第9對引物擴(kuò)增第12、13號外顯子。G6PD基因的13個外顯子中,最小外顯子為第3號外顯子,其長度為38 bp,最大的外顯子為第13號外顯子,長度為700 bp(圖1)。PCR反應(yīng)體系為:0.5 μL TaKaRa LA Taq、25 μL緩沖液、8 μL dNTPs、1 μL DNA、正反引物各1 μL,ddH2O補(bǔ)足體積至50 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,擴(kuò)增35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

    1.5 DNA測序和突變分析

    用雙脫氧鏈終止法技術(shù)對樣品進(jìn)行測序。采用英濰捷基公司3730XL測序儀對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,得到的序列與GenBank中標(biāo)準(zhǔn)參考序列進(jìn)行比對,并使用軟件BioEdit、ClustalX 2.1對序列進(jìn)行分析。突變位點參考HGVS(http://www.hgvs.org/)標(biāo)準(zhǔn)命名。

    1.6 突變危害性的預(yù)測

    用PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、Align GVGD(http://agvgd.iarc.fr/)和MutationTaster(http://www.mutationtaster.org/)軟件預(yù)測突變對蛋白質(zhì)功能的影響程度。PolyPhen-2是基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的原理,Align GVGD基于氨基酸的生物學(xué)特性和蛋白質(zhì)的多序列比對的原理,MutationTaster則是基于氨基酸序列同源性的原理來對突變進(jìn)行預(yù)測。僅當(dāng)兩種或以上軟件均預(yù)測同一突變對蛋白質(zhì)的功能影響較大時,才認(rèn)為該突變具有較強(qiáng)的危害性。

    2 結(jié)果

    2.1 家系臨床資料分析

    患者(先證者)食蠶豆后1 d發(fā)病,有頭暈、發(fā)熱、 倦怠無力、 厭食、 惡心和不定性的腹痛等早期癥狀,出現(xiàn)皮膚鞏膜黃染、貧血以及醬油色尿,遂來醫(yī)院就診。血液檢查提示:1)血紅蛋白急劇下降;2)紅細(xì)胞最低降至0.5×1012/L以下;3)網(wǎng)織紅細(xì)胞明顯增高>0.20;4)外周血涂片可見有核紅細(xì)胞增多;5)白細(xì)胞數(shù)升高。生化檢查提示:葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性減低,臨床診斷為G6PD缺乏癥。此家系中,先證者母親及先證者先后被診斷出具有典型的臨床癥狀,表現(xiàn)為皮膚鞏膜黃染、貧血以及醬油色尿,并且實驗室檢查完全符合診斷標(biāo)準(zhǔn)。先證者父親未曾出現(xiàn)G6PD缺乏癥的臨床癥狀,其血液生化學(xué)檢查,顯示是正常的個體。

    Black blocks represent exons and lines represent introns in this picture圖1 G6PD基因的結(jié)構(gòu)Fig 1 Structure of a G6PD gene

    2.2G6PD基因突變分析

    先證者及其母親在第2號外顯子出現(xiàn)同一點突變(c.95A>G,p.His32Arg),該突變引起組氨酸被精氨酸替換(CAC>CGC);而父親序列未見突變(圖2)。

    2.3 生物信息學(xué)分析

    p.His32Arg突變很可能對蛋白質(zhì)正常功能產(chǎn)生有害作用(表1)。

    3 討論

    G6PD缺乏癥在地理位置上分布廣泛,罹患者遍及全球,估計世界各地約有4億人受累,其危害較大[5]。G6PD是磷酸戊糖旁路途徑的第一個限速酶,能催化6-磷酸葡萄糖生成還原型NADPH[6]。由于成熟的紅細(xì)胞缺乏線粒體及細(xì)胞核,只能通過磷酸戊糖旁路生成NADPH。NADPH能夠使氧化型的谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為還原型的谷胱甘肽。還原型谷胱甘肽對于紅細(xì)胞內(nèi)H2O2和自由基的清除起著重要的作用[7],當(dāng)體內(nèi)H2O2和自由基等氧化性的物質(zhì)產(chǎn)生過多或清除障礙時,可對細(xì)胞膜蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)的酶產(chǎn)生氧化損傷,這些損傷可導(dǎo)致組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的異常。

    表1 生物信息學(xué)預(yù)測突變對蛋白質(zhì)功能的影響Table 1 Predicting the effects of a mutation on protein function by bioinformatics

    The greater the score and prob value ranging from 0 to 1, the greater the damaging; If(GV=0) and (GD> 0).the position of interest is invariant (100% conservation) so any mutation at the position is predicted as damaging[4].

    G6PD基因中第2號外顯子中的堿基A突變?yōu)镚,可導(dǎo)致氨基酸的錯義突變,造成G6PD上的第32位氨基酸發(fā)生改變,由組氨酸變成精氨酸,進(jìn)而導(dǎo)致蛋白的結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變化,最終影響G6PD的酶活性。有研究報道G6PD缺陷癥患者的G6PD基因上的突變位點為c.95A>G[8-9],本研究也得出了相同的結(jié)果。為了進(jìn)一步提供更強(qiáng)的證據(jù)闡明該位點的突變對蛋白質(zhì)功能的影響,本研究使用PolyPhen-2、Align GVGD和MutationTaster對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測該位點的突變是否對蛋白功能產(chǎn)生有害作用。3種方法預(yù)測結(jié)果都顯示了該位點的突變對蛋白的功能將產(chǎn)生有害作用,因此可認(rèn)為該突變具有較強(qiáng)的危害性。

    本次研究檢測到先證者及其母親G6PD基因第2號外顯子的一個錯義突變(c.95A>G),該突變位點在以往研究中已有報道[10-11],在dbSNP數(shù)據(jù)庫編號為rs137852340。此家系中,先證者母親為雜合子,攜帶雜合型G6PD突變型等位基因c.95A>G,先證者為半合子,X染色體上攜帶G6PD突變型等位基因來自于其母親,其父親正常,這符合G6PD缺乏癥伴性顯性遺傳的特點。但由于研究的數(shù)據(jù)量偏小,不能估計其外顯率,也無法對其遺傳機(jī)制進(jìn)行嚴(yán)格的統(tǒng)計分析。本次研究通過對一家系中G6PD缺陷患者進(jìn)行基因突變的鑒定及其臨床表現(xiàn)的觀察,推測了G6PD基因的結(jié)構(gòu)和功能之間可能存在的關(guān)系,基因突變與疾病發(fā)病的具體遺傳機(jī)制需要在更大的家系中進(jìn)一步驗證。

    志謝:本研究承蒙醫(yī)院各醫(yī)生的支持與協(xié)助!

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    Mutation analysis of the pathogenic gene in a Chinese family with G6PD deficiency

    LIN Mei-hua#, CHEN Ye-da#, OUYANG Ping, ZHAO Xiang, TAN Yi-qing,ZHAO Xiao-lei, QIN Ji-heng, RAO Shao-qi*

    (Institute for Medical Systems Biology and School of Public Health, Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China)

    Objective In order to recognize the mutation site as well as its inheritance model. Methods We collected the family trio with G6PD deficiency in Huizhou of Guangdong Province, a region of high prevalence of G6PD deficiency. The family trio includes the proband, his affected mother and healthy father.Their blood samples were collected and genomic DNA was extracted. Sequence analysis was performed in thirteen exons by PCR and DNA sequencing. Results The results indicated that the proband and his mother shared an identical mutation (c.95A>G, p.His32Arg) in exon 2 ofG6PDgene. This mutation caused histidine to be replaced with arginine (CAC>CGC). However, no single mutation was found in his father. Three bioinformatics tools predicted that this mutation was detrimental to the function(s) of its associated protein. Conclusions The mutation, c.95A>G, following an X-linked dominant inheritance model, is a causal site for G6PD deficiency.

    glucose-6-phosphate dehydrogenase; gene mutation; exon sequencing

    2015-01-28

    2015-04-27

    國家自然科學(xué)基金(31071166,81373085);廣東省科技計劃攻關(guān)項目(2009A030301004);東莞市科技重點項目(2011108101015)

    *通信作者(corresponding author):raoshaoq@gdmc.edu.cn

    #對本文有相同貢獻(xiàn)

    1001-6325(2015)08-1011-04

    R394.3

    A

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