NOB1在人胃癌組織中高表達(dá)及臨床意義

李志鋒，陳美青，靳 松，張 剛，趙 芝，孫同偉

(1.河北省保定市第一醫(yī)院 普外科, 河北 保定 071000； 2.河北省定州市人民醫(yī)院 消化科， 河北 定州 073000)

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NOB1在人胃癌組織中高表達(dá)及臨床意義

李志鋒1*，陳美青1，靳 松1，張 剛2，趙 芝2，孫同偉2

(1.河北省保定市第一醫(yī)院 普外科, 河北 保定 071000； 2.河北省定州市人民醫(yī)院 消化科， 河北 定州 073000)

胃癌因高發(fā)病率和高病死率嚴(yán)重威脅人類健康，但有關(guān)胃癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確。NOB1(Nin one binding protein 1)是由NOB1基因編碼的、參與核糖體小亞基和26S蛋白酶體生物合成的多功能蛋白質(zhì)；NOB1異常表達(dá)可影響核糖體和蛋白酶體的生物合成，而后兩者與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌組織中 NOB1 蛋白的表達(dá)，了解NOB1在胃癌中的作用及其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料:收集2009年3月至2014年10月行胃癌根治術(shù)的胃癌標(biāo)本66例，平均57.8歲(38～76歲)，男性37例，女性29例；高分化19例，中分化31例，低分化16例；Ⅰ期10例，Ⅱ期25例，Ⅲ期22例，Ⅳ期9例；其中34例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，32例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；收集30例距胃癌組織2 cm處經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的非癌胃組織及20例良性病變行胃切除的標(biāo)本組織作為對(duì)照組。

1.2 方法:所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。切片脫蠟水化，浸于檸檬酸鹽緩沖液經(jīng)中火檔微波處理行抗原修復(fù)。然后按照SP免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。兔抗人NOB1多克隆抗體(上海研生有限公司)，工作濃度1∶80。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。NOB1蛋白免疫組化染色陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的黃色、棕黃色或棕褐色沉淀。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比和陽(yáng)性細(xì)胞的著色強(qiáng)度，用半定量免疫評(píng)分法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定: (1)著色強(qiáng)度:無(wú)著色為0分，淡黃色為1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。(2)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在計(jì)數(shù)細(xì)胞中所占百分比:陽(yáng)性細(xì)胞≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，> 75%為4分。兩者分值相加:0～2分為陰性， 3～4分為弱陽(yáng)性，≥5分為強(qiáng)陽(yáng)性。每份標(biāo)本置高倍鏡下(×400)選取5個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，盲法判讀，由兩位高年資病理師獨(dú)立觀片后一起作出判斷。

1.3 隨訪:本研究采用電話隨訪結(jié)合主動(dòng)隨訪；末次隨訪時(shí)間為2015年1月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)某一個(gè)理論數(shù)1

2 結(jié)果

2.1 NOB1在不同組織中的表達(dá):NOB1蛋白免疫組化主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色顆粒。在胃癌、癌旁胃組織及正常胃組織中均有不同程度的表達(dá)(圖1)；在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁胃組織及正常胃組織(P<0.05)(表1)。

A.NOB1 expression in normal gastric tissue(-)；B.NOB1 expression in carcinoma-adjacent normal tissue(+)；C.NOB1 expression in gastric cancer tissue(++)

圖1 NOB1蛋白在正常胃組織、癌旁胃組織和胃癌組織的表達(dá)(×400)Fig 1 NOB1 expression in normal gastric tissue，carcinoma adjacent gastric tissue and gastric cancer tissue (×400)

*P<0.05 compared with carcinoma adjacent gastric tissue and normal gastric tissue .

2.2 胃癌中NOB1表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系:NOB1在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理分期呈正相關(guān)，NOB1在胃癌Ⅲ、Ⅳ期組織中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期中陽(yáng)性表達(dá)率(P<0.05)(表2)。

表2 NOB1與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 NOB1的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系:NOB1陽(yáng)性表達(dá)者術(shù)后生存時(shí)間較陰性者明顯縮短，NOB1表達(dá)與胃癌患者術(shù)后5年生存率呈負(fù)相關(guān)，Log-rank值為7.873(P<0.05)。

3 討論

NOB1基因是酵母Nob1p基因的人類同源基因，編碼412個(gè)氨基酸序列的RNA結(jié)合蛋白, 該蛋白的N端含一個(gè)PIN(PilT aminoterminus)結(jié)構(gòu)域, 該結(jié)構(gòu)域可參與核糖核酸酶功能，從而影響核糖體組裝和蛋白質(zhì)的合成；C端含一個(gè)ZNRD1 (zincribbon domain-containing1，鋅帶)結(jié)構(gòu)域，其在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

NOB1通過(guò)PIN結(jié)構(gòu)域參與核糖體小亞基的合成。40S核糖體小亞基的合成包括早期的核仁階段的轉(zhuǎn)錄、rRNA修飾、在A2位點(diǎn)前體rRNA的剪切和晚期的胞質(zhì)階段在D位點(diǎn)前體rRNA剪切。NOB1通過(guò)PIN結(jié)構(gòu)域可與小亞基20S前體rRNA結(jié)合,使核酸內(nèi)切酶在前體核糖體剪切位點(diǎn)D剪切，促進(jìn)18S RNA 的成熟[1]。NOB1表達(dá)異常導(dǎo)致18S RNA不能合成, 20S前體rRNA堆積。核糖體合成的大量蛋白用于細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，NOB1異常將導(dǎo)致核糖體不能正確合成,從而影響細(xì)胞調(diào)控。故此認(rèn)為，NOB1通過(guò)對(duì)核糖體合成的影響是參與細(xì)胞調(diào)控的主要因素。

NOB1可通過(guò)ZNRD1結(jié)構(gòu)域參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。ZNRD1由1個(gè)三股的反平行片狀結(jié)構(gòu)和雜環(huán)構(gòu)成，它是參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，并在轉(zhuǎn)錄中具有重要作用的結(jié)構(gòu)域。有研究表明，ZNRD1是通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期素D1的表達(dá)將細(xì)胞增長(zhǎng)阻滯于G1期，影響細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。

泛素-蛋白酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的重要途徑之一, 通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)某些具有生物活性的蛋白質(zhì),可調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖；選擇性降解癌基因、抑癌基因的相關(guān)產(chǎn)物、凋亡調(diào)控蛋白等,從而調(diào)控細(xì)胞突變。26S蛋白酶體是泛素-蛋白酶體途徑的重要組成部分，由一個(gè)20S的蛋白酶體和2個(gè)19S的調(diào)節(jié)蛋白(RP) 組成。描繪26S蛋白酶體的合成模型：Nob1p與19SRP形成Nob1p-19SRP復(fù)合體，并在細(xì)胞核內(nèi)與20S蛋白酶體前體結(jié)合，分子伴侶Ump1p被降解，19SRP與20S蛋白酶體前體緊密連接，而Nob1p進(jìn)入26S蛋白酶復(fù)合體內(nèi)部降解。當(dāng)產(chǎn)生新的蛋白酶體時(shí)Nob1p的轉(zhuǎn)錄重新開(kāi)始。因此認(rèn)為，NOB1蛋白介導(dǎo)核內(nèi)20S蛋白酶體與19SRP的連接，促進(jìn)了26S蛋白酶體的成熟。NOB1的表達(dá)異常可導(dǎo)致泛素-蛋白酶體途徑失常,降低后者對(duì)細(xì)胞分化、增殖及癌基因、抑癌基因的相關(guān)產(chǎn)物、凋亡調(diào)控蛋白的調(diào)控能力[2]。

NOB1在甲狀腺乳頭狀癌、食管癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)[3]，提示NOB1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但其與腫瘤臨床病理特征關(guān)系并不完全相同。采用PCR和Western印跡法檢測(cè)胰腺癌組織中NOB1基因mRNA及其編碼蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NOB1在胰腺癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤大小呈正相關(guān)；而通過(guò)免疫組化檢測(cè)NOB1在宮頸鱗癌中的表達(dá)情況，結(jié)果表明NOB1表達(dá)與患者腫瘤分化程度及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，提示NOB1的表達(dá)與宮頸鱗癌的預(yù)后有關(guān)，有可能成為宮頸癌治療的靶點(diǎn)及預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)[4]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NOB1在胃癌、癌旁胃組織及正常胃組織中出現(xiàn)不同程度的表達(dá)，在胃癌組織中表達(dá)明顯高于在癌旁胃組織、正常胃組織中的表達(dá)，在癌旁胃組織及正常胃組織中表達(dá)無(wú)明顯差異，表明NOB1表達(dá)增加可能促進(jìn)了胃癌的發(fā)生。NOB1在胃癌的中的表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)，提示NOB1可能在胃癌的侵襲、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。通過(guò)對(duì)NOB1陽(yáng)性表達(dá)率與胃癌患者隨訪結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NOB1的表達(dá)與胃癌患者術(shù)后5年生存率呈負(fù)相關(guān)，提示NOB1表達(dá)與胃癌患者的病情進(jìn)展密切相關(guān)。

綜上所述，NOB1不僅與胃癌的發(fā)生、侵襲關(guān)系密切，而且與預(yù)后存在一定關(guān)聯(lián)；表明NOB1可能成為胃癌的新標(biāo)志物，同時(shí)為胃癌的診治提供了新思路。

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2015- 07- 01

1001-6325(2015)11-1546-03

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*通信作者(corresponding author)：504693127@qq.com