干擾SULT2B1抑制人肝癌細(xì)胞BEL- 7402的上皮間質(zhì)化

楊曉明，李桂忠，田 玨，徐 華，楊曉玲，殷蓮華

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)系，寧夏 銀川 750004；2.復(fù)旦大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海 200032)

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研究論文

干擾SULT2B1抑制人肝癌細(xì)胞BEL- 7402的上皮間質(zhì)化

楊曉明1*，李桂忠1，田 玨1，徐 華1，楊曉玲1，殷蓮華2

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)系，寧夏 銀川 750004；2.復(fù)旦大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海 200032)

目的研究羥基類固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶SULT2B1與人肝癌細(xì)胞BEL- 7402上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系及其作用機制。方法細(xì)胞分為空白對照組(NC)、陰性對照組(control-siRNA)和SULT2B1干擾組(SULT2B1-siRNA)，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，real-time PCR和Western blot檢測干擾效果。Western blot檢測緊密連接蛋白(ZO- 1)、波形蛋白(vimentin)和轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的表達(dá)。結(jié)果SULT2B1干擾BEL- 7402細(xì)胞后其mRNA與蛋白表達(dá)均顯著降低 (P<0.05)，ZO- 1表達(dá)水平升高(P<0.05)，vimentin的表達(dá)及ZEB1的蛋白水平均降低(P<0.05)。結(jié)論干擾SULT2B1通過下調(diào)ZEB1的表達(dá)抑制人肝癌細(xì)胞BEL- 7402的上皮間質(zhì)化。

肝癌細(xì)胞；羥基類固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶SULT2B1；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；ZEB1

羥基類固醇硫酸基轉(zhuǎn)移酶(Hydroxysteroid sulfotransferases)2B1 (SULT2B1)參與了肝臟的氧化固醇硫酸化[1]、脂質(zhì)代謝[2]和肝細(xì)胞再生過程[3- 4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，SULT2B1在人肝癌組織和肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，干擾SULT2B1可抑制肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖[5]。近年來，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的發(fā)生與進展中的作用倍受關(guān)注，腫瘤中的EMT被認(rèn)為是胚胎發(fā)育的再度激活[6]。本研究檢測EMT相關(guān)分子緊密連接蛋白(zonula occludens- 1, ZO- 1)、波形蛋白(vimentin)和E盒鋅指結(jié)合蛋白1(Zinc finger E-box binding homeobox 1, ZEB1)的表達(dá)，探討SULT2B1與人肝癌細(xì)胞BEL- 7402 EMT間的關(guān)系及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞系BEL- 7402(ATCC)。

1.1.2 實驗試劑：DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)、Trizol Reagent 和LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)、RevertAIdTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit #1622(Fermentas公司)、SYBR GREEN supermix(Bio-Rad公司)；BCA-100蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司)、RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物)、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(北京康維世紀(jì)公司)、0.25%胰蛋白酶(杭州吉諾生物公司)、SULT2B1兔多克隆抗體(Abcam公司)、ZO- 1、vimentin和ZEB- 1兔多克隆抗體(Cell Signal Technology公司)、Tubulin兔多克隆抗體(Bioworld公司)、山羊抗兔IgG抗體、山羊抗兔FITC標(biāo)記IgG抗體(Santa Cruz公司)、DAPI染色液(武漢博士德生物公司)；SULT2B1-siRNA序列(SULT2B1-siRNA)和對照序列(control-siRNA)由上海吉凱基因化學(xué)有限公司合成；引物由上海桑尼公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，待BEL- 7402細(xì)胞增殖至鋪滿瓶底后用含0.125%的胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，每3～4 d換液1次。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。

1.2.2 BEL- 7402細(xì)胞免疫熒光染色： 取正常條件下培養(yǎng)24 h 的BEL- 7402細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛溶液室溫固定10 min，PBS漂洗3次，每次5 min，0.5% Triton- 100通透15 min，滴加1% 牛血清白蛋白封閉劑置于37 ℃濕盒中溫育30 min，吸干封閉劑，滴加1∶200稀釋的SULT2B1兔多克隆抗體，同時設(shè)置正常IgG兔多克隆抗體代替一抗的陰性對照，4 ℃孵育過夜。PBS漂洗3次，每次5 min，加入1∶50稀釋熒光素FITC標(biāo)記羊抗兔二抗，37 ℃濕盒孵育30 min，PBS漂洗3次，加入5 μg/mL的DAPI染核2 min(避光)，PBS漂洗3次，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：實驗設(shè)立空白對照組(NC)、陰性對照組(control-siRNA)和SULT2B1干擾組(SULT2B1-siRNA)。轉(zhuǎn)染前，將BEL- 7402細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板中，并將細(xì)胞培養(yǎng)基換成不含血清和抗生素的新鮮培養(yǎng)基，空白對照組不做相應(yīng)處理，SULT2B1干擾組和陰性對照組，用合成的SULT2B1-siRNA(靶序列：5′-CGGAAATCAGC CAGAAGTT-3′)和陰性對照control-siRNA(序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)分別與Lipofect-amineTM2000轉(zhuǎn)染試劑混合后，按說明書進行操作。轉(zhuǎn)染后48 h，抽提細(xì)胞RNA和蛋白，檢測干擾效果。1.2.4 Real-time PCR檢測BEL- 7402細(xì)胞中SULT2B1的mRNA表達(dá)水平：PCR引物序列：SULT2B1：5′-AGTTTGGCTCCTGGTTGG-3′ (上游)、5′-GAGGCAG CAGCGTGTAGTT-3′(下游)；內(nèi)參GAPDH：5′-AAC GGATTTGGTCGTATTG-3′(上游)、5′-GGAAGATGG TGATGGGATT-3′(下游)。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒并按照說明合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束計算實驗組相對于對照組基因表達(dá)量。1.2.5 Western blot檢測BEL- 7402細(xì)胞中SULT2B1、ZO- 1、vimentin和ZEB- 1的表達(dá)水平：采用RIPA裂解緩沖液冰上裂解細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度，每個樣品取20 μg上樣，10% SDS-PAGE、PVDF轉(zhuǎn)膜、用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h，分別用相應(yīng)的SULT2B1抗體(1∶500)、ZO- 1抗體(1∶1 000)、vimentin抗體(1∶1 000)、ZEB- 1抗體(1∶500)和tubulin抗體(1∶5 000)孵育， 4 ℃冰箱中搖床孵育過夜，次日復(fù)溫0.5 h后，TBST洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶2 000)37 ℃孵育45 min，TBST洗3次，每次5 min，ECL顯色，化學(xué)發(fā)光試劑檢測目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SULT2B1在BEL- 7402細(xì)胞中的表達(dá)與定位

SULT2B1在BEL- 7402細(xì)胞中高表達(dá)，且主要分布在胞質(zhì)(綠色熒光)(圖 1)。

2.2 BEL- 7402細(xì)胞中SULT2B1-siRNA片段的干擾效果

BEL- 7402細(xì)胞中轉(zhuǎn)染針對SULT2B1靶序列的siRNA干擾片段后，其mRNA與蛋白表達(dá)水平均顯著低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)(圖2)。

2.3 干擾SULT2B1對ZO- 1與vimentin表達(dá)水平的影響

BEL- 7402細(xì)胞中干擾SULT2B1后，與陰性和空白對照組相比， 上皮標(biāo)志物ZO- 1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P< 0.05)，vimentin的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P< 0.05)(圖3)。

圖1 SULT2B1在BEL- 7402細(xì)胞中的表達(dá)與定位Fig 1 SULT2B1 expression and localization in BEL- 7402 cells(scale bar=200 μm)

The mRNA (A) and protein (B) levels of SULT2B1 in BEL- 7402 cells with SULT2B1-specific siRNA treatment;*P<0.05 compared with control-siRNA group; #P<0.05 compared with NC group

*P<0.05 compared with control-siRNA group; #P<0.05 compared with NC group圖3 干擾SULT2B1對ZO- 1與vimentin表達(dá)水平的影響Fig 3 The effect of SULT2B1 interference on the ZO- 1and vimentin protein expression in humanhepatocarcinoma BEL- 7402 cells

2.4 干擾SULT2B1對轉(zhuǎn)錄因子ZEB1表達(dá)水平的影響

BEL- 7402細(xì)胞中干擾SULT2B1后，轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的蛋白表達(dá)水平較陰性對照組和空白對照組相比均顯著降低(P< 0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control-siRNA group; #P<0.05 compared with NC group圖4 干擾SULT2B1對轉(zhuǎn)錄因子ZEB1表達(dá)水平的影響Fig 4 The effect of SULT2B1 interference on the proteinlevels of transcriptional factor ZEB1 in humanhepatocarcinoma BEL- 7402 cells

3 討論

SULT2B1通過選擇性的催化3β-羥基類固醇參與了機體的多種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。近年發(fā)現(xiàn)， SULT2B1與前列腺癌、乳腺癌和肝癌的發(fā)生有關(guān)[5,7- 8]。本結(jié)果顯示，SULT2B1通過調(diào)控ZEB1轉(zhuǎn)錄因子，影響上皮與間質(zhì)標(biāo)志分子的表達(dá)，參與人肝癌細(xì)胞BEL- 7402 EMT的發(fā)生。

在EMT的發(fā)生過程中，具有極性的上皮細(xì)胞向具有移行能力的間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，同時伴有細(xì)胞標(biāo)志物的改變[9]。主要表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物，如ZO- 1、E-鈣黏素(E-cadherin)等表達(dá)降低；間質(zhì)標(biāo)志物，如vimentin、N-鈣黏素等表達(dá)增加。研究結(jié)果表明，SULT2B1主要表達(dá)于BEL- 7402細(xì)胞的胞質(zhì)，提示，SULT2B1可能在參與BEL- 7402肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為過程中發(fā)揮重要作用。干擾SULT2B1使上皮標(biāo)志物ZO- 1蛋白表達(dá)水平升高，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin的蛋白表達(dá)水平降低。提示，干擾SULT2B1可能抑制BEL- 7402細(xì)胞的上皮間質(zhì)化。

進一步研究表明，SULT2B1影響B(tài)EL- 7402細(xì)胞上皮間質(zhì)物表達(dá)水平的同時，也可降低EMT發(fā)生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的蛋白表達(dá)。ZEB1是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的因子之一[10]。有報道，在非小細(xì)胞性肺癌(non-small cell lung cancers, NSCLCs)中，ZEB1能增加基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2的異常表達(dá)，影響NSCLCs的侵襲與轉(zhuǎn)移[11]。在肝細(xì)胞肝癌中，ZEB1的陽性表達(dá)與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移和患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[12]。在本研究中，SULT2B1引起上皮與間質(zhì)分子的改變，可能通過調(diào)控ZEB1的轉(zhuǎn)錄活性引起的。

綜上，本結(jié)果顯示，干擾SULT2B1通過下調(diào)ZEB1的表達(dá)，引起ZO- 1表達(dá)水平升高、vimentin表達(dá)水平降低，進而抑制人肝癌細(xì)胞BEL- 7402的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

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SULT2B1 interference inhibits the epithelial-mesenchymaltransition of human hepatocellular carcinoma BEL- 7402 cells

YANG Xiao-ming1*, LI Gui-zhong1, TIAN Jue1, XU Hua1, YANG Xiao-ling1, YIN Lian-hua2

(1.Dept. of Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004;2.Dept. of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China)

Objective To investigate the relationship of hydroxysteroid sulfotransferase 2B1 (SULT2B1) and epithelial-mesenchymal transition (EMT), exploring its possible mechanisms. Methods Cells were divided into three groups: control group, negative control siRNA group and SULT2B1-siRNA group. LipofectamineTM2000 was employed for transient transfection. The SULT2B1 interference efficiency in treated BEL- 7402 cells was detected by real-time PCR and western blot assays respectively. The protein levels of zonula occludens- 1 (ZO- 1), vimentin and transcriptional factor ZEB1 in BEL- 7402 cells with SULT2B1 interference were determined by western blot analysis. Results The mRNA and protein levels of SULT2B1 in treated BEL- 7402 cells were decreased significantly as compared with the negative control group (P< 0.05). The protein level of ZO- 1 was significantly up-regulated(P<0.05), while vimentin and the transcriptional factor ZEB1 were decreased in BEL- 7402 cells with SULT2B1 interference (P<0.05). Conclusions SULT2B1 interference can inhibit the epithelial-mesenchymal transition of BEL- 7402 cells by down-regulating transcriptional factor ZEB1.

hepatocellular carcinoma；hydroxysteroid sulfotransferases 2B1；epithelial-mesenchymal transition；ZEB1

2015- 04- 28

2015- 07- 01

寧夏自然科學(xué)基金資助項目(NZ14074)

1001-6325(2015)11-1503-05

R735.7

A

*通信作者(corresponding author)：yxming1999 @163.com